Fiche de révision : Séquençage Sanger et PCR

📋 Plan du Cours

1. Principe de la méthode Sanger
2. Terminaison de chaîne par ddNTP
3. Séparation des fragments d’ADN
4. Lecture des séquences obtenues
5. Résultats manuels et automatisés
6. Structure et complémentarité de l’ADN
7. Brin cible et interprétation du résultat
8. Séquençage Sanger et PCR

📖 1. Principe de la méthode Sanger

🔑 Notions clés & Définitions

• Séquençage Sanger : Frederick Sanger, 1977 - Le séquençage Sanger, aussi appelé méthode de terminaison de chaîne, est une méthode permettant de déterminer la séquence de nucléotides de l’ADN.

📖 2. Terminaison de chaîne par ddNTP

★ À maîtriser

• La PCR à terminaison de chaîne utilise l’ADN d’intérêt comme matrice et un faible rapport de ddNTP avec les dNTP normaux ; l’incorporation aléatoire d’un ddNTP arrête l’élongation et produit des fragments terminés à différentes longueurs.

• Les ddNTP ne possèdent pas le groupe 3′-OH nécessaire à la formation de la liaison phosphodiester avec le nucléotide suivant.

Compléments

• Lors de l’extension de la PCR standard, l’ADN polymérase forme une liaison phosphodiester entre le groupe 3′-OH du dernier nucléotide et le 5′-phosphate du suivant.

• Les quatre réactions manuelles utilisent chacune un type de ddNTP :

  • ddATP
  • ddTTP
  • ddGTP
  • ddCTP

• Le séquençage Sanger automatisé mélange les quatre ddNTP dans une seule réaction et marque chacun d’une étiquette fluorescente unique.

💡 Astuce mémo

Absence du 3′-OH → arrêt de l’élongation

📖 3. Séparation des fragments d’ADN

★ À maîtriser

• L’électrophorèse sur gel sépare les oligonucléotides terminés par chaîne selon leur taille : sous l’effet du courant, l’ADN chargé négativement migre vers l’électrode positive et les fragments les plus petits se déplacent le plus vite.

Compléments

• Comme les fragments d’ADN ont la même charge par unité de masse, leur vitesse de migration dans le gel dépend de leur taille.

• Dans un gel, les oligonucléotides sont ordonnés du plus petit au plus grand lorsqu’on lit les bandes de bas en haut.

💡 Astuce mémo

Petit fragment : rapide ; grand fragment : lent

📖 4. Lecture des séquences obtenues

★ À maîtriser

• La séquence est déterminée en lisant les fragments du plus petit au plus grand, car chaque ddNTP terminal identifie le nucléotide correspondant du brin synthétisé dans le sens 5′ à 3′.

Compléments

• L’ADN polymérase synthétise l’ADN dans le sens 5′ à 3′ à partir d’une amorce fournie.

• Dans le séquençage automatisé, un laser excite les marqueurs fluorescents des fragments et un ordinateur identifie les ddNTP terminaux à partir de la lumière émise.

• Le chromatogramme représente les pics fluorescents correspondant aux nucléotides le long de l’ADN modèle.

📖 5. Résultats manuels et automatisés

★ À maîtriser

📌 Le séquençage manuel sépare les fragments dans quatre voies correspondant aux quatre ddNTP, tandis que le séquençage automatisé les sépare dans une seule électrophorèse sur gel capillaire.

Compléments

• En séquençage manuel, la bande observée dans la voie ddGTP indique que le fragment se termine par une guanine.

💡 Astuce mémo

Quatre voies manuelles, une voie capillaire fluorescente automatisée

📖 6. Structure et complémentarité de l’ADN

🔑 Notions clés & Définitions

• ADN : Molécule composée de deux brins enroulés l’un autour de l’autre pour former une double hélice, chaque brin étant constitué d’une chaîne de désoxyribonucléotides.

📝 Points essentiels

• Les bases azotées des deux brins d’ADN sont liées par des liaisons hydrogène entre bases complémentaires.

📖 7. Brin cible et interprétation du résultat

★ À maîtriser

📌 La séquence lue dépend du brin ciblé par l’amorce : si l’amorce cible le brin complémentaire de la séquence d’intérêt, le résultat correspond au brin d’intérêt ; si elle cible le brin d’intérêt, le résultat correspond à son brin complémentaire et doit être reconverti.

Compléments

• Pour une séquence d’intérêt TACG, une amorce ciblant ce brin produit ATGC, qu’il faut reconvertir en TACG ; une amorce ciblant le brin complémentaire ATGC produit directement TACG.

💡 Astuce mémo

Amorce sur le brin cible : lire le complément ; amorce sur l’autre brin : lire le brin cible

📖 8. Séquençage Sanger et PCR

★ À maîtriser

📌 La PCR vise à amplifier la séquence d’ADN dans son intégralité, tandis que le séquençage Sanger produit des fragments terminés de toutes les longueurs possibles jusqu’à la longueur de la cible.

Compléments

• Les ingrédients de la PCR sont : l’ADN cible, des nucléotides, une amorce d’ADN, une ADN polymérase, notamment la Taq polymérase

• Le séquençage Sanger nécessite des didésoxynucléotides en plus du matériel de départ de la PCR afin de générer des fragments terminés.

• La PCR peut fournir de nombreuses copies de l’ADN qui sera séquencé, et un plus grand nombre de matrices rend le protocole Sanger plus efficace.

💡 Astuce mémo

PCR amplifie toute la cible ; Sanger produit des fragments terminés de longueurs variées