Fiche de révision : Techniques d’études de biologie cellulaire

📋 Plan du Cours

1. Fondements et pouvoir de résolution
2. Échantillons et préparation cellulaire
3. Microscopie optique classique
4. Microscopies optiques spécialisées
5. Microscopie électronique et confocale
6. Études biochimiques in situ
7. Cytométrie et fractionnement cellulaire
8. Anticorps monoclonaux et ELISA
9. Chromatographie et électrophorèse
10. Autres techniques biologiques

📖 1. Fondements et pouvoir de résolution

🔑 Notions clés & Définitions

• Pouvoir de résolution : La plus petite distance observable entre deux points sans qu’ils soient confondus, et plus cette distance D est petite, plus le microscope est puissant.

★ À maîtriser

• Le pouvoir de résolution dépend de l’indice de réfraction N, de la longueur d’onde λ du faisceau et de l’angle α du cône lumineux entrant dans l’objectif.

📌 Les techniques morphologiques décrivent la forme des cellules et des tissus, tandis que les techniques d’étude in situ localisent leurs constituants biochimiques.

Compléments

• Le pouvoir de résolution de l’œil humain est d’environ 0,2 mm.

💡 Astuce mémo

D petit = microscope puissant ; D grand = distinction moindre

📖 2. Échantillons et préparation cellulaire

📝 Points essentiels

• Les cellules vivantes peuvent être cultivées dans des boîtes de Petri ou des tubes à 37 °C, dans une atmosphère humidifiée contenant 5 % de CO2 et un milieu adapté avec nutriments ou facteurs de croissance.

• 🔄 La congélation rapide suit plusieurs étapes:

  1. Congeler la biopsie dans l’azote liquide avec des cryoprotecteurs
  2. Couper la biopsie au cryostat
  3. Fixer puis colorer la coupe

• 🔄 La préparation classique suit plusieurs étapes:

  1. Fixer avec des aldéhydes
  2. Déshydrater et inclure en paraffine ou en résine
  3. Refroidir et durcir l’inclusion
  4. Couper au microtome ou à l’ultramicrotome

• Les coupes destinées au microscope optique ont généralement une épaisseur d’environ 5 μm, tandis que les coupes destinées au MET ont une épaisseur d’environ 50 nm.

💡 Astuce mémo

Prélever → fixer ou congeler → couper → colorer

📖 3. Microscopie optique classique

🔑 Notions clés & Définitions

• Microscope optique standard : Utilise des photons qui traversent successivement le condenseur, l’objectif et l’oculaire afin de former une image.

★ À maîtriser

📌 L’observation au microscope optique standard nécessite une coupe fine, presque transparente, et une coloration comme l’éosine ou l’hémalun pour augmenter le contraste.

• Le microscope optique standard permet d’observer la forme et l’aspect des cellules et des noyaux, mais pas la plupart des structures infracellulaires.

Compléments

• Avec un objectif de grossissement maximal ×100 et un oculaire ×10, le microscope optique standard atteint un grossissement total d’environ ×400.

📖 4. Microscopies optiques spécialisées

🔑 Notions clés & Définitions

• Microscope à contraste de phase : Transforme les différences de phase produites par la déviation des ondes lumineuses dans les structures cellulaires en différences de brillance.
• Microscope à fluorescence : Détecte des molécules fluorescentes qui absorbent une longueur d’onde λ1 et émettent une lumière de longueur d’onde supérieure λ2.

★ À maîtriser

📌 Le microscope à contraste de phase ne nécessite ni coupe, ni fixation, ni coloration et permet d’observer des cellules vivantes, leurs organites en mouvement et leur division.

Compléments

• La fluorescéine absorbe dans le bleu et émet dans le jaune-vert, tandis que la rhodamine absorbe dans le vert et émet dans le rouge.

💡 Astuce mémo

Contraste de phase : cellules vivantes ; fluorescence : molécules marquées

📖 5. Microscopie électronique et confocale

🔑 Notions clés & Définitions

• Microscope électronique à transmission : Utilise un faisceau d’électrons qui traverse une coupe ultrafine dans un vide poussé et permet d’observer les structures infracellulaires.

• Microscope électronique à balayage : Dirige un faisceau d’électrons sur la surface d’un échantillon entier métallisé et produit une image en relief de cette surface.

★ À maîtriser

• Le microscope confocal utilise un laser et réalise des coupes optiques successives permettant de reconstruire des images tridimensionnelles plus nettes d’échantillons parfois épais.

Compléments

• Le MET fonctionne sous une tension de 40 à 100 kV et peut atteindre des grossissements de 30 000, 50 000 ou 100 000 fois.

💡 Astuce mémo

MET traverse l’échantillon ; MEB explore sa surface

📖 6. Études biochimiques in situ

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunohistologie : Localise des molécules antigéniques, principalement des protéines et des glycoprotéines, grâce à une interaction spécifique entre antigène et anticorps.

• Hybridation in situ : Localise une séquence d’acide nucléique grâce à une sonde simple brin marquée et complémentaire de la séquence recherchée.

📝 Points essentiels

📌 Le marquage direct associe le marqueur à l’anticorps qui reconnaît l’antigène, tandis que le marquage indirect utilise un anticorps secondaire marqué qui reconnaît l’anticorps primaire et amplifie le signal.

• L’autoradiographie suit dans le temps des macromolécules après incubation d’un tissu avec un précurseur radioactif, exposition à une émulsion photographique et révélation de grains d’argent noirs.

💡 Astuce mémo

Chimie → enzyme → anticorps → sonde → radioactivité

📖 7. Cytométrie et fractionnement cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Cytométrie de flux : Fait défiler rapidement des cellules marquées par des anticorps fluorescents afin de les différencier, les compter et les trier selon leur fluorescence.

📝 Points essentiels

• La cytométrie de flux est utilisée pour:

  • Le typage des leucémies
  • La numération des sous-populations lymphocytaires
  • L’analyse du cycle cellulaire
  • La détection d’aneuploïdies

• La centrifugation différentielle sépare les constituants cellulaires par centrifugations successives d’un homogénat, en récupérant à chaque étape le culot et en recentrifugeant le surnageant.

• Une centrifugation de 10 minutes à 1 000 g sédimente le noyau et les débris, une centrifugation de 20 minutes à 20 000 g sédimente les mitochondries, lysosomes et peroxysomes, et une centrifugation de 60 minutes à 80 000 g sédimente des fragments du réticulum endoplasmique appelés microsomes.

💡 Astuce mémo

La cytométrie trie des cellules ; la centrifugation sépare leurs organites

📖 8. Anticorps monoclonaux et ELISA

📝 Points essentiels

• 🔄 La fabrication d’anticorps monoclonaux suit plusieurs étapes:
  1. Immuniser une souris
  2. Récupérer les lymphocytes B
  3. Fusionner les lymphocytes B avec des cellules de myélome
  4. Sélectionner les clones producteurs
  5. Amplifier les clones sélectionnés

📌 L’ELISA indirect dose ou recherche un anticorps dans l’échantillon, tandis que l’ELISA sandwich dose ou recherche un antigène dans l’échantillon.

📌 Dans l’ELISA, l’intensité de la coloration produite par une enzyme liée à un anticorps secondaire est mesurée au spectrophotomètre et dépend de la quantité d’antigène ou d’anticorps présente.

💡 Astuce mémo

Immuniser → fusionner → sélectionner → amplifier

📖 9. Chromatographie et électrophorèse

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie : Sépare et purifie les constituants d’un mélange grâce à une phase mobile et une phase fixe, les molécules migrant à des vitesses différentes.
• Western Blot : Consiste à transférer les protéines séparées sur une membrane de nitrocellulose puis à les détecter avec un anticorps marqué spécifique de l’antigène recherché.

📝 Points essentiels

📌 La chromatographie d’exclusion sépare les protéines uniquement selon leur taille, tandis que la chromatographie d’affinité les sépare selon leur interaction spécifique avec un ligand, comme un anticorps.

• En électrophorèse, les protéines sont dénaturées par chauffage avec du SDS et un agent réducteur, déposées dans un gel de polyacrylamide, puis séparées par un courant selon leur poids moléculaire.

💡 Astuce mémo

Chromatographie sépare dans une colonne ; électrophorèse sépare dans un gel

📖 10. Autres techniques biologiques

★ À maîtriser

• Les techniques de biologie moléculaire comprennent:
  • L’extraction
  • La purification
  • La détermination des séquences
  • La PCR
  • La RT-PCR

Compléments

• La radioactivité permet de détecter et de suivre le devenir de molécules d’ADN ou de protéines.

• Les outils informatiques permettent de rechercher des séquences de protéines ou d’acides nucléiques dans des bases de données.

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des principaux microscopes

Comparaison des techniques in situ