Fiche de révision : Variants de l’anhydrase carbonique II

📋 Plan du Cours

1. Anhydrase carbonique II sauvage
2. Rétention du zinc par les mutants
3. Effet sur le pKa et la catalyse
4. Reconnaissance des inhibiteurs
5. Bilan fonctionnel des mutations

📖 1. Anhydrase carbonique II sauvage

🔑 Notions clés & Définitions

• Anhydrase carbonique II : Métalloenzyme qui catalyse la réaction $H_2O + CO_2 \rightleftharpoons HCO_3^- + H^+$.

★ À maîtriser

• Dans l’anhydrase carbonique II sauvage, le zinc possède une géométrie de coordination tétraédrique et est coordonné par les histidines His 94, His 96 et His 119.

• Le pKa de l’eau libre est d’environ 15,7, tandis que celui de l’eau complexée dans l’anhydrase carbonique II est de 6,8.

Compléments

• La structure de l’anhydrase carbonique II est référencée par le code PDB 1MOO.

📖 2. Rétention du zinc par les mutants

★ À maîtriser

• Les variants de l’anhydrase carbonique II sont obtenus par mutagénèse, puis leur capacité à maintenir le zinc dans la sphère de coordination est étudiée à un pH similaire au pH physiologique.

• La rétention du zinc par les variants est caractérisée par la constante de dissociation du zinc KD et par la demi-vie de rétention t1/2.

Compléments

• L’étude des variants prend en compte des changements conformationnels, électroniques et thermodynamiques du site de liaison du zinc.

💡 Astuce mémo

Modification des ligands → perte de rétention du zinc

📖 3. Effet sur le pKa et la catalyse

★ À maîtriser

• Toute substitution des histidines coordinantes du zinc diminue kcat/KM d’un facteur compris entre 3 et 300 et augmente le pKa de l’eau au-dessus du pH physiologique.

• À pH 8,9, l’hydratation du CO2 par les variants entraîne une diminution de kcat/KM comprise entre 20 et 10 000 fois et une diminution de kcat comprise entre 3 et 1000 fois.

Compléments

• L’hydrolyse du p-nitrophényl acétate est utilisée pour étudier le pKa de l’eau dans le site actif.

💡 Astuce mémo

Substitution des histidines → pKa accru → activité réduite

📖 4. Reconnaissance des inhibiteurs

🔑 Notions clés & Définitions

• Acétazolamide : Inhibiteur de l’anhydrase carbonique, bon ligand du zinc et analogue de l’état de transition.

📝 Points essentiels

• L’affinité des variants pour l’acétazolamide est étudiée en mesurant la dissociation de cet inhibiteur.

📖 5. Bilan fonctionnel des mutations

📝 Points essentiels

• Les changements du site de liaison du zinc provoquent une perte de la capacité de rétention du zinc par l’enzyme.

• Les changements du site de liaison du zinc provoquent une augmentation du pKa de l’eau présente dans le site actif.

• Les changements du site de liaison du zinc provoquent une perte d’affinité pour un inhibiteur connu de l’anhydrase carbonique II et une forte diminution de l’activité catalytique. — Kiefer, L. L.; Fierke, C. A., Functional Characterization of Human Carbonic Anhydrase II Variants with Altered Zinc Binding Sites, 1994

💡 Astuce mémo

Site du zinc altéré → zinc moins retenu, eau moins activée et catalyse affaiblie

📊 Tableaux de synthèse

Conséquences des mutations du site du zinc