Fiche de révision : Méthodes d’analyses tissulaires

📋 Plan du Cours

1. Fondements et histoire de l’histologie
2. Échelles du vivant et résolution
3. Principes de la microscopie
4. Microscopie optique et électronique
5. Signaux en microscopie électronique
6. Microscopies électroniques MET et MEB
7. Fixation et inclusion des tissus
8. Coupe et préparation pour la microscopie
9. Colorations histologiques
10. Marquages moléculaires et applications
11. Artefacts et interprétation des lames
12. Immunomarquages et hybridation in situ

📖 1. Fondements et histoire de l’histologie

🔑 Notions clés & Définitions

• Histologie : Discipline qui étudie les tissus et leur organisation, notamment grâce au marquage et à l’observation de préparations.

★ À maîtriser

• T. Schwann et R. Virchow sont présentés comme les deux pères de l’histologie grâce à la théorie cellulaire.

• La cellule est l’unité fondamentale du vivant, les cellules forment des tissus, les tissus forment des organes et les organes forment des systèmes ou appareils.

Compléments

• M. Malpighi a commencé à étudier les tissus vivants au XVIIe siècle avec un microscope rudimentaire et a observé les capillaires pulmonaires.

• L’histologie se situe à l’interface de la physique, de la chimie, des mathématiques, de la physiologie et de l’anatomopathologie.

💡 Astuce mémo

Cellule → tissu → organe → système

📖 2. Échelles du vivant et résolution

📝 Points essentiels

• La capacité résolutive de l’œil humain est d’environ 200 μm, tandis que celle d’un microscope optique atteint environ 200 nm.

• La microscopie électronique permet d’atteindre une résolution allant jusqu’à environ 0,2 nm et d’observer des structures proches de l’échelle atomique.

• À l’échelle du foie, l’œil observe l’organe et une lame d’hépatectomie, le microscope optique observe le lobule hépatique, les travées et les hépatocytes, et le microscope électronique observe les mitochondries et l’échelle nucléosomale.

💡 Astuce mémo

Œil : grand ensemble ; microscope : détail cellulaire

📖 3. Principes de la microscopie

🔑 Notions clés & Définitions

• Résolution : Distance minimale séparant deux points individualisables.

📝 Points essentiels

📐 Formule — La résolution est décrite par l’équation d’Airy $d = 0{,}61\frac{\lambda}{n\sin\alpha}$.

📌 Pour améliorer la résolution, il faut diminuer la longueur d’onde λ ou augmenter l’angle α des rayons entrant dans l’objectif.

• La microscopie optique utilise des photons, tandis que la microscopie électronique utilise des électrons.

💡 Astuce mémo

Photon ou électron selon la résolution recherchée

📖 4. Microscopie optique et électronique

📝 Points essentiels

• Dans un microscope, le rayonnement traverse successivement la source, le condenseur, l’échantillon, l’objectif et le projecteur pour former l’image finale grossie.

📌 En microscopie optique, les lentilles sont en verre et le grossissement se règle en changeant d’objectif, tandis qu’en microscopie électronique les lentilles sont électromagnétiques et le grossissement se règle par la lentille projecteur.

📌 L’échantillon peut être non déshydraté et observé de manière non destructrice en microscopie optique, tandis qu’il doit être déshydraté et est soumis à un faisceau destructeur en microscopie électronique.

💡 Astuce mémo

MO : verre et photons ; ME : électroaimants et électrons

📖 5. Signaux en microscopie électronique

📝 Points essentiels

📌 La diffusion inélastique transfère de l’énergie à l’échantillon et produit une zone claire, tandis que la diffusion élastique dévie fortement l’électron sans transfert d’énergie et produit une zone sombre.

💡 Astuce mémo

Diffusion inélastique : clair ; diffusion élastique : sombre

📖 6. Microscopies électroniques MET et MEB

📝 Points essentiels

📌 En MET, les électrons traversent l’échantillon et produisent une image en 2D avec une résolution supérieure à celle du MEB.

📌 En MEB, les électrons se réfléchissent sur la surface de l’échantillon et permettent une visualisation en 3D avec une résolution d’environ 1 nm.

💡 Astuce mémo

MET traverse en 2D ; MEB balaie la surface en 3D

📖 7. Fixation et inclusion des tissus

🔑 Notions clés & Définitions

• Fixation : Empêche la dégradation intrinsèque par cytolyse et nécrose ainsi que la dégradation extrinsèque par contamination microbienne, tout en durcissant le prélèvement.

★ À maîtriser

• 🔄 L’inclusion en paraffine comprend: la déshydratation par des bains d’éthanol croissants, la clarification au xylène, l’imprégnation en paraffine chaude, la mise en bloc de paraffine

Compléments

📌 La déshydratation commence avec de l’éthanol à 60 % et se termine avec de l’éthanol anhydre à 100 % afin de permettre l’utilisation du xylène.

💡 Astuce mémo

Fixer → déshydrater → clarifier → imprégner → bloquer

📖 8. Coupe et préparation pour la microscopie

★ À maîtriser

• Le microtome réalise des coupes de paraffine de 3 à 5 μm d’épaisseur.

📌 Pour la microscopie électronique, l’échantillon est fixé au glycéraldéhyde et au tétraoxyde d’osmium, inclus dans une résine dure et coupé à moins de 100 nm avec un ultramicrotome.

Compléments

• Les bandelettes de paraffine sont étalées sur un bain d’eau puis récupérées sur une lame de verre afin d’éviter les plis.

💡 Astuce mémo

MO : paraffine et microtome ; ME : résine et ultramicrotome

📖 9. Colorations histologiques

★ À maîtriser

📌 Dans la coloration HE, l’hématoxyline basique colore en bleu-violet les compartiments acides basophiles, tandis que l’éosine acide colore en rouge rosé les compartiments basiques éosinophiles ou acidophiles.

• La coloration HES associe l’hématoxyline et l’éosine au safran, qui colore surtout les tissus conjonctifs en jaune-orangé ou jaune-saumoné.

Compléments

• Le trichrome de Masson colore les noyaux et substances basophiles en bleu-violet, le cytoplasme en rouge foncé et les tissus conjonctifs en bleu pâle.

• Le PAS met en évidence certains mucopolysaccharides en magenta, notamment le mucus et le revêtement du plateau strié intestinal.

💡 Astuce mémo

Hématoxyline : noyaux basophiles ; éosine : cytoplasmes éosinophiles

📖 10. Marquages moléculaires et applications

📝 Points essentiels

• L’immunohistologie détecte des protéines avec des anticorps, tandis que l’hybridation in situ détecte des séquences d’ADN ou d’ARN avec des sondes nucléiques complémentaires.

• En marquage direct, l’anticorps primaire porte la molécule reportrice, tandis qu’en marquage indirect l’anticorps secondaire reconnaît l’anticorps primaire et peut amplifier le signal.

• En immunohistochimie, l’activité enzymatique de la HRP ou de la phosphatase alcaline transforme la DAB en précipité insoluble au site de fixation de l’anticorps.

• En immunofluorescence, un fluorochrome excité à une longueur d’onde spécifique émet des photons d’une autre longueur d’onde, comme Alexa 488 excité à 488 nm et émettant à 535 nm.

💡 Astuce mémo

Protéines par anticorps ; acides nucléiques par sondes

📖 11. Artefacts et interprétation des lames

🔑 Notions clés & Définitions

• Artéfact : Altération de l’observation liée à la technique de préparation et qui ne doit pas être interprétée comme une structure réelle du tissu.

📝 Points essentiels

• Les replis tissulaires, les résidus sanguins intravasculaires et le décollement tissulaire rétinien sont des exemples d’artéfacts de préparation.

📖 12. Immunomarquages et hybridation in situ

★ À maîtriser

• L’hybridation in situ dénature l’ADN par ébullition, puis permet aux sondes fluorescentes complémentaires de s’hybrider à la séquence cible lors du refroidissement.

• Dans la FISH HER2, autant de signaux HER2 rouges que de signaux du chromosome 17 verts indiquent l’absence d’amplification, tandis qu’une majorité de signaux rouges indique une amplification de HER2.

Compléments

• En microscopie électronique, l’immuno-gold utilise des anticorps secondaires portant des billes d’or, qui apparaissent très sombres car elles sont denses aux électrons.

• Un marquage positif de CD3 par immunohistochimie permet de repérer les lymphocytes T d’une tumeur mammaire par un précipité marron de DAB.

💡 Astuce mémo

Cible reconnue → signal localisé → diagnostic ou choix thérapeutique

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des microscopes

Comparaison MET et MEB