Fiche de révision : Méthodes d’étude en histologie

📋 Plan du Cours

1. Nature et classification des tissus
2. Microscope optique et trajet lumineux
3. Résolution et contraste optiques
4. Fluorescence et microscopie confocale
5. Préparation des tissus en microscopie optique
6. Fixation et inclusion en paraffine
7. Coupe et coloration histologique
8. Détection des constituants cellulaires
9. Immunohistochimie et anticorps
10. Histochimie et analyses moléculaires
11. Microscopie électronique et résolution
12. Préparation en microscopie électronique

📖 1. Nature et classification des tissus

🔑 Notions clés & Définitions

• Tissu : Association de cellules différenciées de même nature, éventuellement associées aux substances intercellulaires qu’elles élaborent.

★ À maîtriser

📌 Un épithélium est constitué de cellules jointives, sans substance intercellulaire, reposant sur une lame basale, tandis que les cellules conjonctives sont non jointives, séparées par une substance intercellulaire et ne reposent pas sur une lame basale.

Compléments

• Les épithéliums peuvent revêtir des tissus ou des cavités, ou sécréter des substances sous forme d’épithéliums glandulaires.

• Les tissus conjonctifs spécialisés comprennent les tissus cartilagineux, osseux, sanguin, médullaire, adipeux et lymphoïde.

• Le tissu nerveux, qualifié de para-épithélium, est formé de cellules polarisées et jointives, séparées des autres tissus par une membrane basale, et transmet des informations.

• Les tissus musculaires sont proches des tissus conjonctifs, assurent la contraction et présentent l’équivalent d’une lame basale.

💡 Astuce mémo

Épithélium jointif sur lame basale, conjonctif séparé sans lame basale

📖 2. Microscope optique et trajet lumineux

★ À maîtriser

• Un microscope optique comprend un objet à observer, des dispositifs de grossissement et de correction des aberrations, puis un récepteur tel qu’une rétine ou une caméra.

• 🔄 Le trajet optique suit les étapes suivantes :

  1. La source lumineuse émet des photons.
  2. Le condenseur concentre les photons sur la préparation.
  3. L’objectif forme l’image.
  4. L’oculaire agrandit l’image.
  5. Le récepteur recueille le signal.

📌 L’objectif porte la qualité optique de l’image, tandis que l’oculaire joue un rôle de loupe et n’améliore pas la qualité de l’observation.

Compléments

• En microscopie optique, l’échantillon doit être transparent, contrasté et placé dans le trajet de la lumière visible.

• Le grossissement de l’objectif est généralement d’une dizaine de fois et atteint au maximum 130 fois, tandis que le grandissement de l’oculaire est faible, autour de ×10.

💡 Astuce mémo

Source → condenseur → préparation → objectif → oculaire → récepteur

📖 3. Résolution et contraste optiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Résolution : Distance minimale entre deux points de la préparation qui peuvent être séparés sur l’image.

★ À maîtriser

📐 Formule - La limite de résolution est donnée par $d = \frac{0{,}61\lambda}{NA}$, où $\lambda$ est la longueur d’onde et $NA = n'\sin v'$ l’ouverture numérique de l’objectif.

• Un très bon microscope optique en lumière blanche sépare deux points distants de 100 à 200 nm, soit 0,1 à 0,2 μm.

Compléments

• Une longueur d’onde plus courte, notamment dans le bleu ou l’ultraviolet, améliore la résolution par rapport au rouge ou à l’infrarouge.

• Une ouverture numérique plus grande améliore la résolution, et l’huile d’immersion peut être interposée entre la préparation et l’objectif pour l’améliorer.

💡 Astuce mémo

Deux points proches donnent deux taches d’Airy qui finissent par se chevaucher

📖 4. Fluorescence et microscopie confocale

★ À maîtriser

• En épifluorescence, un fluorochrome absorbe une longueur d’onde d’excitation et réémet des photons de longueur d’onde plus longue, par exemple une excitation bleue suivie d’une émission verte.

• 🔄 Le signal d’épifluorescence est filtré ainsi :
  1. Le filtre d’excitation sélectionne la longueur d’onde incidente.
  2. Le miroir dichroïque réfléchit la lumière d’excitation vers l’échantillon.
  3. Le fluorochrome réémet une lumière de longueur d’onde différente.
  4. Le miroir laisse passer la fluorescence vers le détecteur.
  5. Le filtre d’émission arrête la longueur d’onde d’excitation.

• La microscopie confocale utilise un laser monochromatique et une illumination point par point dans un plan focal fin, puis reconstitue informatiquement les signaux recueillis.

• La microscopie confocale permet d’observer une préparation épaisse de 40 à 50 μm en recueillant des coupes optiques de 0,5 μm ou moins et de reconstruire des objets en trois dimensions.

Compléments

📌 La microscopie à contraste de phase sert notamment à observer l’évolution de cultures cellulaires vivantes, tandis que le contraste interférentiel est utilisé pour étudier des structures minérales comme l’os.

💡 Astuce mémo

Le laser focalisé point par point → des plans optiques reconstruits en 3D

📖 5. Préparation des tissus en microscopie optique

★ À maîtriser

• La préparation histologique en microscopie optique comprend la fixation, l’inclusion, la coupe au microtome et la coloration.

• La fixation protège le tissu de la putréfaction et de l’autolyse afin de conserver les cellules dans un état morphologique proche du vivant.

Compléments

• La décalcification des tissus minéralisés échange le calcium contre d’autres substances et rend les tissus osseux mous avant leur préparation.

• L’inclusion remplace l’eau du tissu par un milieu d’imprégnation afin de le rendre homogène, semi-transparent et assez dur pour être coupé à épaisseur constante.

💡 Astuce mémo

Fixer → inclure → couper → colorer

📖 6. Fixation et inclusion en paraffine

★ À maîtriser

• La fixation par immersion dans un produit chimique est la technique la plus utilisée en histologie, tandis que la perfusion diffuse le fixateur dans le système circulatoire d’un animal sacrifié.

• Le formaldéhyde, ou formol, conserve et stabilise les protéines en formant des ponts méthylènes entre elles et à l’intérieur d’elles.

Compléments

📌 La congélation rapide, ou vitrification, doit atteindre au moins −80 °C ou utiliser des gaz liquéfiés comme l’azote liquide, tandis qu’une congélation trop lente entraîne la formation de cristaux.

📌 Le paraformaldéhyde est plus stable que le formol et est davantage utilisé en recherche et en biologie cellulaire, tandis que le glutaraldéhyde est surtout utilisé en microscopie électronique.

• Les autres fixateurs cités sont :
  • l’acide acétique
  • l’acide formique
  • l’acide nitrique
  • l’éthanol
  • l’isopropanol
  • le zinc
  • le chrome
  • le mercure

📖 7. Coupe et coloration histologique

★ À maîtriser

• La paraffine, milieu d’inclusion le plus utilisé en microscopie optique, est liquide à 56 °C et solide à température ambiante, et elle n’est pas miscible à l’eau.

• L’inclusion en paraffine comprend la déshydratation dans des bains d’alcool de concentrations croissantes, le remplacement de l’alcool par un solvant intermédiaire miscible avec la paraffine, puis l’imprégnation par des bains successifs de paraffine liquide.

• Le microtome réalise des coupes de 1,5 à 20 μm selon l’usage, souvent de 3 à 4 μm, et une cellule épithéliale de 15 μm peut ainsi être présente dans cinq coupes successives.

Compléments

• Les bains de déshydratation à l’éthanol peuvent être réalisés aux concentrations de 50 %, 70 %, 90 %, 95 % et 100 %.

• Le xylène, le plus souvent utilisé, et le toluène sont des exemples de solvants intermédiaires miscibles avec l’alcool et la paraffine.

📖 8. Détection des constituants cellulaires

★ À maîtriser

• L’hématoxyline colore en violet les acides nucléiques du noyau, tandis que l’éosine ou l’érythrosine colore en rouge ou rose les protéines du cytoplasme.

📌 Les lipides sont difficiles à conserver et à mettre en évidence en paraffine, car les solvants utilisés lors de l’inclusion, notamment le xylène, en retirent presque la totalité ; leur étude peut utiliser des échantillons congelés.

Compléments

• Le safran colore en vert la matrice extracellulaire sans spécificité.

• Les protéines et les peptides sont relativement faciles à mettre en évidence après fixation en paraffine ou congélation, et leur analyse est importante car ils donnent le plus souvent sa fonction à la cellule.

💡 Astuce mémo

La paraffine facilite les coupes, mais retire presque tous les lipides

📖 9. Immunohistochimie et anticorps

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunohistochimie : Détection in situ de protéines ou de peptides dans un tissu à l’aide d’anticorps couplés à une technique de marquage.

★ À maîtriser

• Un anticorps, ou immunoglobuline, reconnaît un épitope spécifique de la protéine grâce à sa partie variable.

• Les anticorps polyclonaux, issus de plusieurs clones, sont généralement très sensibles et obtenus en grande quantité, mais ils sont peu spécifiques et génèrent un bruit de fond important.

• Les anticorps monoclonaux proviennent d’un clone sélectionné et immortalisé par fusion ou hybridation cellulaire ; ils sont très spécifiques mais moins sensibles que les sérums polyclonaux.

• L’immunohistochimie directe utilise un anticorps marqué reconnaissant l’antigène, tandis que la méthode indirecte utilise un anticorps primaire non marqué puis un anticorps secondaire marqué dirigé contre lui.

Compléments

• Les anticorps peuvent être détectés au moyen de fluorochromes, d’isotopes radioactifs comme le tritium ou le soufre 35, ou d’enzymes comme la phosphatase alcaline et la peroxydase.

💡 Astuce mémo

Polyclonal : sensible mais peu spécifique ; monoclonal : spécifique mais moins sensible

📖 10. Histochimie et analyses moléculaires

🔑 Notions clés & Définitions

• Histochimie : Ensemble de colorations signalétiques mettant en évidence un composé spécifique ; elle est moins fine que l’immunohistochimie.
• Hybridation in situ : Mise en évidence de séquences d’ARN ou d’ADN dans une coupe de tissu en faisant hybrider une sonde complémentaire à la séquence cible.

📝 Points essentiels

• Les lectines sont des protéines très présentes dans le monde végétal qui se fixent sur des motifs sucrés spécifiques, tels que des disaccharides ou des oligosaccharides.

• L’analyse de l’ADN par hybridation in situ nécessite de le dénaturer afin d’obtenir de l’ADN simple brin.

📌 En FISH, la sonde porte un fluorochrome et permet notamment d’analyser un petit fragment chromosomique, tandis que la digoxygénine ou la biotine peut être révélée par un anticorps associé à une enzyme pour détecter, par exemple, de l’ARN viral.

• En MALDI-TOF, un laser ionise pixel par pixel une coupe déposée sur une matrice, les ions vaporisés sont accélérés dans un spectromètre, puis leur temps de trajet permet d’établir des spectres de lipides, de protéines et de sucres.

📖 11. Microscopie électronique et résolution

★ À maîtriser

📌 Le microscope électronique utilise des électrons à la place des photons et doit fonctionner dans une enceinte sous vide poussé, car les électrons interagissent fortement avec l’air.

• La microscopie électronique permet d’observer l’ultrastructure subcellulaire à une résolution de l’ordre du nanomètre, selon le type de microscope.

📌 En microscopie électronique à transmission, les électrons traversent la préparation et la résolution est optimale, tandis qu’en microscopie électronique à balayage la résolution est moindre mais permet une reconstruction en trois dimensions.

Compléments

• La résolution du microscope électronique dépend de la longueur d’onde des électrons et de leur accélération, liée à une différence de potentiel d’environ 100 000 volts entre l’anode et la source.

• Le premier microscope électronique date de 1931 et a été conçu en Allemagne.

💡 Astuce mémo

Transmission : électrons à travers la coupe ; balayage : reconstruction 3D

📖 12. Préparation en microscopie électronique

★ À maîtriser

• Dans le microscope électronique à transmission, les électrons sont produits par une source, accélérés par l’anode, focalisés par le condenseur, transmis à travers la préparation, puis recueillis par un système de réception.

• La préparation pour microscopie électronique exige une fixation très rapide, notamment au glutaraldéhyde, car toute dégradation ou autolyse altère fortement les images.

📌 La paraffine ne convient pas à la microscopie électronique, qui utilise des résines très dures comme l’Epon ; des tissus congelés peuvent aussi être coupés au cryoultramicrotome.

Compléments

• En microscopie électronique à transmission, les coupes sont déposées sur des grilles microscopiques plutôt que sur des lames de verre.

• Les coupes pour microscopie électronique à transmission ont une épaisseur de 50 à 100 nm, après obtention éventuelle de coupes semi-fines de 500 nm, et sont réalisées avec un ultramicrotome et des couteaux en diamant.

• Les coupes en microscopie électronique sont contrastées par des sels de métaux lourds comme l’osmium, l’uranium ou le plomb, l’uranium étant aujourd’hui remplacé par des sels de lanthane en raison de sa toxicité.

💡 Astuce mémo

Fixer → résine dure → ultracoupe → sels de métaux lourds

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des techniques électroniques