Fiche de révision : Microscopie électronique et cytologie

📋 Plan du Cours

1. Principe et architecture tissulaire
2. Dépôts matriciels et pigments
3. Mise en évidence des agents figurés
4. Identifier des cellules particulières
5. Colorations histoenzymatiques
6. Immunohistochimie, détection et amplification du signal
7. Antigènes et identification cellulaire
8. Immunomarquage et micro-métastases
9. Typage et pronostic des tumeurs
10. Hybridation in situ par FISH
11. Prélèvement, fixation, inclusion et coupes électroniques
12. Microscopie électronique et immunomarquage
13. Principes et indications de la cytologie
14. Prélèvements cytologiques
15. Colorations et analyses des lames

📖 1. Principe et architecture tissulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Coloration histochimique : Coloration qui révèle sur une coupe tissulaire des composés chimiques particuliers par la formation d’un précipité coloré.

★ À maîtriser

• La coloration de Perls libère in situ le fer sous forme de FeCl₃ par l’acide chlorhydrique, puis le ferrocyanure de potassium forme un précipité bleu insoluble de ferrocyanure ferrique.

• Dans le foie des mammifères, les hépatocytes sont organisés en travées de Remak disposées en une seule couche sur un support de fibres de réticuline, essentiel à l’agencement cellulaire mais invisible en coloration H.E.

Compléments

• La méthode de Gordon-Sweet par imprégnation argentique révèle les fibres de réticuline sous forme d’éléments fins, torsadés et noirs, ce qui permet d’évaluer l’architecture et la régularité du support hépatique.

📖 2. Dépôts matriciels et pigments

★ À maîtriser

• Le trichrome de Masson colore le collagène en bleu et permet de reconnaître une fibrose, dont les causes peuvent être variées.

• La coloration au rouge Congo colore en rose les dépôts de substance amyloïde et oriente vers une amyloïdose.

• La coloration de Perls colore en bleu les pigments intra-hépatocytaires contenant du fer et constitue un marqueur d’hémochromatose.

• La rhodamine colore en rouge les pigments intra-hépatocytaires contenant du cuivre et constitue un marqueur de la maladie de Wilson.

• La coloration de Hall colore en vert les pigments intra-hépatocytaires contenant de la bilirubine et constitue un marqueur de stase biliaire.

Compléments

• Dans un glomérule rénal, des amas roses extracellulaires colorés à l’éosine sont probablement des dépôts protéiques, mais leur nature peut être précisée par une coloration spéciale.

💡 Astuce mémo

Le fer devient bleu avec Perls, le cuivre rouge avec la rhodamine et la bilirubine verte avec Hall.

📖 3. Mise en évidence des agents figurés

★ À maîtriser

• La coloration de Ziehl-Neelsen met en évidence les bacilles acido-alcoolo-résistants, notamment des mycobactéries responsables de maladies telles que la tuberculose.

• La coloration P.A.S. révèle les hyphes et les spores des champignons, mais ne permet pas d’identifier leur nature.

Compléments

• Dans le poumon d’un serpent, des bacilles acido-alcoolo-résistants observés dans le cytoplasme des macrophages à la coloration de Ziehl-Neelsen indiquent une mycobactériose.

• Dans l’intestin bovin, l’accumulation intracytoplasmique de bacilles Ziehl positifs indique une paratuberculose.

📌 La coloration de Gram est standard en bactériologie, mais elle est difficile à réaliser en histologie et manque de précision.

• Les bactéries spiralées sont mises en évidence grâce à des sels d’argent.

📖 4. Identifier des cellules particulières

★ À maîtriser

📌 Un mastocyte est une cellule normale, tandis qu’un mastocytome est une tumeur d’origine mastocytaire.

• Le bleu de Toluidine colore en violet les grains cytoplasmiques des mastocytes et permet de confirmer l’origine mastocytaire d’une tumeur peu différenciée.

📌 Les cellules endocrines intestinales sont petites, à noyau allongé et basal, et leur cytoplasme est peu visible et étiré, contrairement aux entérocytes hauts à microvillosités et aux mucocytes joufflus à noyau basal.

📌 Les cellules endocrines libèrent leur produit de sécrétion dans le tissu conjonctif puis dans le sang, tandis que les cellules exocrines le déversent directement dans la lumière intestinale.

Compléments

• Un mastocyte normal du derme présente un noyau régulier, ovalaire et central, ainsi qu’un cytoplasme développé contenant des grains.

• Dans un mastocytome peu différencié, les cellules ont des noyaux irréguliers et très encochés, et leurs cytoplasmes contiennent peu de grains.

• La coloration de Grimelius fait apparaître en brun les cellules endocrines intestinales, qui ne sont autrement ni visibles ni quantifiables.

💡 Astuce mémo

Grimelius révèle les cellules endocrines, tandis que le bleu de Toluidine révèle les grains mastocytaires.

📖 5. Colorations histoenzymatiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Coloration histoenzymatique : Détecte une activité enzymatique par la formation d’un précipité coloré en présence d’un substrat spécifique de l’enzyme et d’un révélateur.

★ À maîtriser

📌 Les colorations histoenzymatiques nécessitent une congélation rapide et précise du tissu pour éviter les cristaux, et les tissus fixés au formol sont inutilisables car leurs protéines, dont les enzymes, sont dénaturées.

📌 Les cellules musculaires de type I sont lentes et oxydatives, avec des ATPases actives à pH acide, tandis que les cellules de type II sont rapides et glycolytiques, avec des ATPases actives à pH basique.

Compléments

• La congélation du tissu s’effectue en quelques secondes dans de l’isopentane à −160 °C, refroidi au préalable par contact avec de l’azote liquide.

• À pH acide 4,3, les cellules musculaires de type I apparaissent noires et les cellules de type II ne sont pas colorées.

• À pH basique 9,4, les cellules musculaires de type II sont colorées et les cellules de type I ne le sont pas.

💡 Astuce mémo

ATPase acide : type I ; ATPase basique : type II.

📖 6. Immunohistochimie, détection et amplification du signal

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunohistochimie : Met en évidence des antigènes spécifiques dans une coupe de tissu au moyen d’un anticorps spécifique associé à un générateur de signal.

★ À maîtriser

• En immunohistochimie, l’anticorps se fixe spécifiquement à l’antigène présent et déclenche, par son générateur de signal souvent enzymatique, la formation d’un précipité coloré visualisable.

📌 Les fixateurs chimiques peuvent altérer les antigènes protéiques, empêcher leur reconnaissance par l’anticorps et produire un faux négatif en immunohistochimie.

• Le formol crée des ponts méthylène au niveau des acides aminés basiques, ce qui modifie la structure tridimensionnelle des protéines et peut altérer leurs épitopes.

📌 Des ponts méthylène formés sur l’épitope peuvent modifier sa reconnaissance par l’anticorps sans nécessairement le détruire définitivement, tandis que des ponts formés ailleurs dans la protéine modifient sa structure tertiaire et rendent l’épitope inaccessible.

• Une fixation prolongée augmente la formation de ponts méthylène et diminue le nombre de cellules colorées en dénaturant les protéines ; la surfixation risque donc de masquer ou de détruire des épitopes.

📌 La méthode directe associe un seul signal à un antigène, alors que la méthode Avidine Biotine Complexe (ABC) amplifie fortement le signal.

• La méthode ABC permet d’associer environ 1000 générateurs de signal à un antigène, rendant détectables en microscopie optique des antigènes présents en petite quantité.

Compléments

• Le générateur de signal associé à l’anticorps peut être un fluorochrome ou une enzyme.

• L’immunohistochimie est très spécifique et le signal obtenu est stable dans le temps, ce qui est avantageux lorsque les rinçages sont nombreux.

• Le démasquage antigénique par traitement chimique ou thermique casse les ponts méthylène et peut rendre accessibles les épitopes masqués.

• La méthode directe peut ne pas rendre visible en microscopie optique un antigène très peu exprimé, car son signal est trop faible.

• Dans la méthode ABC, un anticorps primaire reconnaît l’antigène, un anticorps secondaire reconnaît l’anticorps primaire et porte de la biotine, puis la biotine fixe un complexe contenant de l’avidine et un générateur de signal.

💡 Astuce mémo

Fixateur dénature l’antigène → anticorps non reconnu → faux négatif.

📖 7. Antigènes et identification cellulaire

★ À maîtriser

• Les filaments intermédiaires des cellules épithéliales sont constitués de kératine, ceux des cellules mésenchymateuses de vimentine et ceux des cellules musculaires de desmine.

• Un immunomarquage positif à l’anti-kératine permet d’identifier une origine épithéliale lorsque la morphologie tumorale ne suffit pas à déterminer le type cellulaire.

• Ki 67 est détectable dans le noyau d’une cellule lorsqu’elle est engagée dans un cycle de division, de G1 à M, et permet d’estimer l’index de prolifération d’une population.

Compléments

• Les anticorps dirigés contre des antigènes spécifiques permettent de repérer des agents infectieux, notamment des protozoaires, des virus et des bactéries, à condition que leur spécificité soit vérifiée.

• Les séquences antigéniques proches entre virus ou entre bactéries peuvent compromettre la spécificité des anticorps utilisés pour identifier un agent infectieux.

• Dans l’exemple présenté, l’index de prolifération Ki 67 va de 0 pour une faible prolifération à 95 % pour une forte prolifération.

• Au début de l’apoptose, une cellule ressemble à une cellule saine en coloration Hémalun-Eosine, ce qui empêche de distinguer microscopiquement ces deux états.

💡 Astuce mémo

KVD : kératine, vimentine, desmine

📖 8. Immunomarquage et micro-métastases

🔑 Notions clés & Définitions

• Micro-métastase : Petit groupe de cellules tumorales qui a quitté son territoire d’origine, a migré par les vaisseaux lymphatiques et s’est développé dans un ganglion lymphatique.

★ À maîtriser

• La recherche de micro-métastases ganglionnaires par anti-kératine révèle des cellules épithéliales tumorales parfois invisibles en histologie standard colorée à l’Hémalun-Eosine.

Compléments

• La présence de cellules épithéliales dans un ganglion sain indique, dans le contexte d’une suspicion de tumeur épithéliale, des cellules tumorales pouvant constituer des micro-métastases.

📖 9. Typage et pronostic des tumeurs

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunoblastes : De grandes cellules à noyaux volumineux et à cytoplasme abondant, d’origine lymphoïde.

★ À maîtriser

• Une coloration spéciale révèle une tumorisation dans 15 % des ganglions déclarés sains par le pathologiste.

📌 Les immunoblastes B et T sont morphologiquement identiques en coloration H.E. et ne peuvent être distingués par cette méthode.

📌 Un immunomarquage CD 79a identifie un lymphome immunoblastique B, tandis qu’un immunomarquage CD 3 identifie un lymphome immunoblastique T.

• Dans le grading de Patnaik, les groupes I, II et III représentent respectivement 36 %, 43 % et 20 % des chiens, avec des survies à quatre ans de 83 %, 44 % et 6 %. - A. Patnaik, 1984

• Dans l’étude de J. Abadie, la survie à deux ans des chiens ayant un index Ki 67 inférieur à 10 % était de 88 %, contre 34 % lorsque l’index dépassait 10 %.

Compléments

• Le CD 4 repère le sous-groupe lymphocytaire T4, tandis que le CD 8 repère les lymphocytes T cytotoxiques T8.

• Connaître le type de lymphome permet d’adapter le traitement, qui diffère selon ce type.

• En 1984, A. Patnaik a classé 83 mastocytomes canins en trois groupes à partir de cinq critères histologiques, dont l’architecture, la morphologie et le nombre de mitoses.

• En 1999, J. Abadie a étudié 60 mastocytomes cutanés canins de grade II et les a répartis selon un index Ki 67 inférieur ou supérieur à 10 %.

💡 Astuce mémo

CD 79a marque la lignée B ; CD 3 marque la lignée T

📖 10. Hybridation in situ par FISH

🔑 Notions clés & Définitions

• Hybridation in situ : Une technique qui localise, sur des coupes tissulaires, des séquences spécifiques d’ADN ou d’ARN à l’aide de sondes marquées.

★ À maîtriser

• La FISH comprend la déparaffinisation et la réhydratation de la coupe, la dénaturation de l’ADN par chauffage, puis l’application d’une sonde marquée spécifique des acides nucléiques recherchés.

📌 En FISH, la présence de la séquence recherchée permet à la sonde de s’hybrider et produit un signal positif, tandis que son absence ne produit aucun signal.

Compléments

• La FISH permet de détecter du matériel exogène de type viral et nécessite des sondes spécifiques de l’agent pathogène recherché.

• La FISH est peu utilisée en médecine vétérinaire, mais presque systématique chez l’humain.

💡 Astuce mémo

Dénaturer, sonder, détecter

📖 11. Prélèvement, fixation, inclusion et coupes électroniques

★ À maîtriser

• La microscopie électronique permet d’observer les organites avec un grossissement environ 1 000 fois supérieur à celui de la microscopie optique.

📌 La fixation d’un prélèvement pour microscopie électronique doit être précoce, car des artéfacts apparaissent dès 10 minutes après la mort.

📌 La fixation en microscopie électronique utilise du glutaraldéhyde dilué dans un tampon préparé au dernier moment, puis une post-fixation à l’acide osmique sous hotte en raison de sa toxicité pour les voies respiratoires.

• Les coupes destinées à la microscopie électronique ont une épaisseur d’environ 0,05 μm, contre 1 à 4 μm en microscopie optique.

• Une coupe semi-fine d’environ 1 μm est colorée au bleu de Toluidine afin de sélectionner la zone d’intérêt avant l’analyse ultrafine.

• Après sélection de la zone d’intérêt, le bloc est retaillé en coupe ultrafine de 0,05 μm avec un ultramicrotome muni d’un rasoir en diamant.

Compléments

• Les échantillons destinés à la microscopie électronique sont très petits, de l’ordre de 1 mm, et peuvent provenir de recoupes de biopsies.

• Pour obtenir un prélèvement adapté, une biopsie fraîche est recoupée en très petits fragments à l’aide d’une lame de rasoir.

• L’acide osmique préserve les lipides, notamment les membranes cellulaires, et noircit les prélèvements.

📌 Le formol pénètre trop lentement pour une fixation immédiate en microscopie électronique ; un tissu formolé et inclus en paraffine peut néanmoins être examiné, mais avec de nombreux artéfacts.

• Le traitement du tissu remplace progressivement son eau par des alcools, puis les alcools par des solvants miscibles à une résine époxy synthétique telle que l’Epon, dans laquelle le tissu est inclus à chaud dans un moule.

• La coupe semi-fine au bleu de Toluidine peut mettre en évidence les mastocytes.

• Dans l’ultramicrotome, le chauffage dilate le socle métallique et fait monter le bloc jusqu’au rasoir de diamant, qui coupe l’échantillon.

💡 Astuce mémo

Fixation tardive → apparition rapide d’artéfacts

📖 12. Microscopie électronique et immunomarquage

★ À maîtriser

• En microscopie électronique à transmission, les coupes ultrafines sont déposées sur une grille métallique de 2 mm de diamètre et l’image obtenue est en noir et blanc.

• En microscopie électronique, l’acétate d’uranyle colore les acides nucléiques et le citrate de plomb colore les membranes.

• En immunomarquage électronique, de petites billes d’or d’environ 10 nm fixées à un anticorps primaire rendent les antigènes repérables sous forme de points, car l’or est un métal lourd.

Compléments

• La microscopie électronique coûte cher, demande beaucoup d’entretien et nécessite un prélèvement de grande qualité ainsi que du matériel adéquat.

• En médecine vétérinaire, la microscopie électronique est peu utilisée, sauf notamment pour certaines pathologies glomérulaires nécessitant l’observation des membranes.

• Les doubles marquages en microscopie électronique permettent de rechercher deux antigènes différents en utilisant des billes d’or de tailles distinctes.

• L’immunohistochimie peut mettre en évidence des structures comme le collagène IV, des cellules comme les cellules épithéliales ou les lymphocytes T, ainsi que des états comme la division cellulaire, et permettre des comptages.

📌 La cellule de Langerhans est un macrophage de la peau et ne doit pas être confondue avec les îlots de Langerhans.

💡 Astuce mémo

L’or lourd apparaît en points, contrairement aux barres de la grille, invisibles.

📖 13. Principes et indications de la cytologie

🔑 Notions clés & Définitions

• Cytologie : Examen morphologique d’amas cellulaires ou de cellules isolées, extraits de leur contexte tissulaire, étalés sur une lame de verre et colorés pour être observés au microscope.

★ À maîtriser

📌 La cytologie permet d’évaluer la morphologie cellulaire, la chromatine et la coloration du cytoplasme avec peu d’artéfacts de fixation, mais elle renseigne difficilement sur l’architecture tissulaire, car les cellules sont séparées de leur agencement initial.

Compléments

• Les prélèvements proviennent généralement de :

  • masses solides
  • ponctions profondes
  • épanchements cavitaires
  • moelle osseuse

• L’examen cytologique, éventuellement guidé par des images échographiques, aide à déterminer l’origine des cellules et à obtenir des informations utiles au choix d’un traitement adapté.

💡 Astuce mémo

Cellules étalées : morphologie visible, architecture perdue.

📖 14. Prélèvements cytologiques

★ À maîtriser

• Lors d’une cytoponction, une seringue de 5 ou 10 mL enfoncée dans le tissu crée une dépression qui aspire les cellules dans l’aiguille et sa garde; le liquide d’une lésion liquide peut, lui, monter spontanément dans la seringue.

📌 Lors d’une cytoponction, l’arrivée de sang dans la seringue signale une effraction vasculaire et impose l’arrêt de la ponction.

• Pour analyser un épanchement cavitaire, le liquide trop dilué pour être étalé directement est concentré par centrifugation, ou concentré et étalé sur lame par cytocentrifugation; ces procédés modifient un peu l’aspect cellulaire.

Compléments

• Pour obtenir un prélèvement représentatif par cytoponction, il faut réorienter l’aiguille dans plusieurs parties de la masse sans la retirer, puis attendre que le piston revienne en position basse.

• Pour étaler un prélèvement de cytoponction, on remplit la seringue d’air, expulse le prélèvement sur une lame, pose une lamelle et appuie légèrement afin d’obtenir une seule couche cellulaire, puis on laisse sécher la lame à l’air libre pendant 2 à 3 minutes.

📌 Un prélèvement cytologique séché à l’air libre ne nécessite pas d’autre fixateur; le formol risque d’abîmer les cellules et d’empêcher la coloration.

• La cytoponction est un examen rapide qui peut être réalisé en présence du propriétaire et de l’animal; l’envoi au laboratoire n’est pas toujours nécessaire, sauf pour expertise.

• Pour prélever la moelle osseuse, les grains récoltés avec une seringue spéciale sont déposés sur des lames de verre puis étalés.

📖 15. Colorations et analyses des lames

★ À maîtriser

• La coloration standard des lames cytologiques est le MGG (May Grünwald et Giemsa), qui fait ressortir les noyaux en rouge et les cytoplasmes en bleu ou les laisse non colorés.

📌 En cytologie, on observe des cellules entières, tandis qu’en histologie on observe des tranches de cellules.

• En cytoenzymologie, l’ajout du substrat spécifique permet de rechercher l’activité d’une enzyme; si elle est présente, une précipitation se produit.

Compléments

• La coloration MGG est simple et rapide, dure 30 minutes et permet l’observation microscopique après séchage de la lame.

• La coloration cytochimique PAS met en évidence les glucides en rouge et sert notamment à repérer les cellules qui contiennent ou produisent des oses.

• Lors de la recherche de myéloperoxydase, des grains noirs dans le cytoplasme indiquent la présence de l’enzyme et identifient des cellules myéloïdes, notamment des granulocytes.

📌 L’immunocytochimie préserve les antigènes de surface grâce à l’absence de fixateur et à la faible épaisseur de la couche cellulaire, alors qu’en histologie ces antigènes sont souvent dénaturés et l’analyse porte alors sur la partie intracytoplasmique de la protéine transmembranaire.

📊 Tableaux de synthèse

Colorations des dépôts et pigments

Colorants spéciaux et éléments révélés