Fiche de révision : Analyse du polymorphisme génétique

📋 Plan du Cours

1. Objectifs et portée de la génomique
2. Principes du séquençage de l’ADN
3. Séquençage enzymatique de Sanger
4. Lecture et automatisation Sanger
5. Séquençage Illumina à haut débit
6. Séquençage de troisième génération et méthylation de l’ADN
7. Assemblage des séquences génomiques
8. Métagénomique des écosystèmes
9. Annotation des phases codantes
10. Prédiction fonctionnelle par homologie
11. Génomique comparative et évolution
12. Approches de la post-génomique
13. Mesures moléculaires et biologie des systèmes
14. Détection des mutations et marqueurs liés
15. Séquences répétées du génome eucaryote
16. Séquences répétées du génome humain
17. Définition et génotypage des SNP
18. Cartes génétiques et diagnostic médical

📖 1. Objectifs et portée de la génomique

🔑 Notions clés & Définitions

• Génomique : Science qui étudie les génomes afin de comprendre leur formation, leur maintien et leurs fonctions.

★ À maîtriser

• La génomique étudie les génomes en séquençant l’ADN, en identifiant leurs éléments constitutifs, comme les gènes et les motifs, et en analysant leur expression à travers les ARN et les protéines.

Compléments

• Les données génomiques disponibles concernent des dizaines de milliers d’espèces et, pour certaines espèces, plusieurs centaines ou milliers d’individus.

📖 2. Principes du séquençage de l’ADN

★ À maîtriser

• La plupart des méthodes actuelles de séquençage suivent l’addition séquentielle, par des polymérases, de bases marquées complémentaires à une matrice d’ADN.

• Les techniques de séquençage courantes lisent généralement quelques dizaines à quelques centaines de nucléotides par opération, alors qu’un génome peut compter plusieurs millions ou milliards de nucléotides.

• Le séquençage d’un génome nécessite de lire une collection de fragments chevauchants, puis d’assembler les séquences obtenues.

Compléments

📌 La méthode historique obtient les fragments à séquencer par clonage dans une banque génomique, tandis que les méthodes de deuxième génération utilisent directement des fragments isolés auxquels des adaptateurs sont liés.

• Dans les méthodes de deuxième génération, les adaptateurs fournissent des séquences flanquantes connues nécessaires à l’amplification par PCR et/ou au séquençage ultérieur des fragments.

📖 3. Séquençage enzymatique de Sanger

★ À maîtriser

• La méthode de terminaison di-désoxy de Sanger, introduite en 1977, a été la seule méthode de séquençage utilisée jusqu’à ces dernières années et sert aujourd’hui surtout à séquencer des fragments courts de quelques centaines à quelques milliers de paires de bases.

• Pour chaque clone, un oligonucléotide synthétique s’hybride à une région du vecteur proche du site de clonage, avec son extrémité 3’OH orientée vers l’insert à séquencer.

• L’oligonucléotide est allongé par une ADN polymérase thermostable en présence des quatre dNTP et d’un seul type de ddNTP à faible concentration.

• Lorsqu’un ddNTP est incorporé à la place du dNTP correspondant, l’élongation de l’ADN s’arrête, ce qui produit des brins terminés à différentes positions possibles.

Compléments

• Dans la méthode de Sanger décrite, l’ADN est fragmenté aléatoirement et les fragments sont clonés séparément dans des vecteurs pour constituer une banque.

• Les réactions d’hybridation, d’élongation et de terminaison peuvent être réalisées directement sur une préparation d’ADN dont une partie de la séquence est connue et permet de définir l’amorce de séquençage.

💡 Astuce mémo

Amorcer, allonger, arrêter : l’incorporation d’un ddNTP termine l’élongation.

📖 4. Lecture et automatisation Sanger

★ À maîtriser

• En séquençage Sanger, les fragments sont séparés selon leur taille sur un gel de polyacrylamide, puis la séquence est lue à partir des bandes marquées radioactivement ou par fluorescence.

• Dans le séquençage Sanger automatisé, les produits des réactions peuvent être marqués par des fluorophores différents, mélangés et analysés sur une même piste ; la couleur émise identifie chaque lettre de la séquence.

Compléments

• Après dénaturation, les étapes de séquençage Sanger sont répétées et chaque réaction produit des simples brins terminés aléatoirement aux sites d’incorporation possibles des ddNTP.

• Un séquenceur capillaire sépare les bandes selon leur taille dans un capillaire contenant un gel et les identifie par la longueur d’onde de leur fluorescence.

📖 5. Séquençage Illumina à haut débit

★ À maîtriser

📌 Les méthodes NGS de deuxième génération séparent et séquencent des molécules isolées sans clonage, contrairement à la méthode Sanger décrite ici, qui nécessite une banque de fragments clonés dans des plasmides puis purifiés en grand nombre.

• La méthode Illumina fragmente aléatoirement l’ADN, ajoute des adaptateurs synthétiques connus, dénature et fixe les brins sur une puce, les amplifie en clusters, puis détermine les bases par incorporation cyclique de nucléotides fluorescents.

📌 Les lectures courtes et les séquences répétées compliquent l’assemblage de novo avec Illumina, tandis que le reséquençage aligne les lectures sur le génome déjà assemblé d’un individu de la même espèce.

Compléments

• Le séquençage Sanger du premier génome humain, d’environ 3 milliards de nucléotides, a coûté plusieurs dizaines de millions de dollars et duré plusieurs années.

• Dans la méthode Illumina, le blocage chimique du groupe 3’-OH du nucléotide incorporé empêche l’ajout d’une seconde molécule pendant le cycle ; le blocage est ensuite retiré pour permettre le cycle de lecture suivant.

• Les méthodes Illumina peuvent produire plusieurs gigabases de séquence brute en quelques jours.

• Le reséquençage par Illumina peut servir à analyser la diversité au sein d’une espèce ou, chez l’humain, la distribution des SNP et des marqueurs de prédisposition aux maladies.

💡 Astuce mémo

Fragmenter → adapter → fixer et amplifier en clusters → lire par cycles fluorescents.

📖 6. Séquençage de troisième génération et méthylation de l’ADN

★ À maîtriser

📌 Les techniques de troisième génération séquencent de longues molécules uniques, par l’activité d’une polymérase ou par lecture de la structure des bases, et présentent des taux d’erreur de 5 à 20 %, contre moins de 1 % pour les techniques précédentes.

• Les lectures de troisième génération mesurent de quelques kilobases à quelques dizaines de kilobases, voire des centaines de kilobases, ce qui facilite l’assemblage en dépassant souvent la longueur des séquences répétées.

• Le séquençage SMRT de PacBio suit des réactions de polymérisation isolées dans des micro-cellules ; chaque dNTP porte un fluorophore spécifique, libéré lors de son incorporation, dont la longueur d’onde identifie la base.

• Le séquençage MinION d’Oxford Nanopore fait passer l’ADN à travers une porine dans une membrane lipidique ; les bases modifient l’amplitude du courant ionique, et leur forme stérique permet de les distinguer.

📌 Dans le séquençage SMRT, la cinétique de réaction s’allonge lorsqu’une base de la matrice est méthylée, tandis que dans la méthode MinION, une base méthylée induit une résistance différente de celle d’une base non modifiée.

Compléments

• Les techniques SMRT et MinION permettent de détecter la méthylation de l’ADN.

💡 Astuce mémo

PacBio voit la fluorescence libérée ; MinION mesure le courant perturbé dans une porine.

📖 7. Assemblage des séquences génomiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Approche shotgun : L’approche shotgun consiste à assembler automatiquement les séquences de fragments aléatoires d’un génome.

• Scaffold : Assemblage de contigs liés ; idéalement, le nombre de scaffolds obtenus est égal au nombre de chromosomes de l’organisme.

★ À maîtriser

• Les assembleurs reconstituent des contigs en recherchant les zones de recouvrement entre les courtes séquences obtenues par séquençage.

• Les trous d’un assemblage résultent de l’échantillonnage stochastique des molécules et des séquences répétées que l’assembleur ne peut pas discriminer.

• Le séquençage des deux extrémités d’un fragment long peut relier deux contigs : si chaque extrémité correspond à un contig différent, leur proximité sur le génome permet de les juxtaposer et de les orienter.

Compléments

• Un trou de taille limitée peut être comblé en déterminant sa séquence après amplification par PCR.

📖 8. Métagénomique des écosystèmes

🔑 Notions clés & Définitions

• Métagénomique : Production de contigs à partir de génomes mélangés extraits d’un biotope, chaque contig représentant une portion du génome d’un organisme présent dans l’écosystème.

★ À maîtriser

• Même sans reconstruire les génomes, l’annotation des contigs peut renseigner sur les principales fonctions des organismes dans un biotope.

Compléments

• Lorsque le mélange contient peu d’organismes prédominants, il est possible d’espérer reconstruire in silico au moins certains des génomes qui le composent.

• Le phylogenetic binning identifie les contigs associés aux différents génomes à partir de propriétés telles que le pourcentage de G+C et le profil des dinucléotides, ce qui peut permettre une reconstruction même partielle des génomes.

• Des algorithmes peuvent prédire les interactions entre organismes à partir des données métagénomiques, éventuellement complétées par des données métatranscriptomiques et métaprotéomiques.

• Pour rechercher directement des fonctions, l’ADN extrait peut être cloné dans des vecteurs d’expression puis les clones exprimant les fonctions recherchées peuvent être identifiés par criblage ou sélection si l’hôte exprime correctement l’information génétique étrangère.

📖 9. Annotation des phases codantes

🔑 Notions clés & Définitions

• Phase ouverte de lecture : Séquence comprise entre deux codons stop dans une phase de lecture.

★ À maîtriser

• Une séquence d’ADN possède six phases de lecture possibles, trois sur chaque brin.

• Une ORF doit contenir un codon d’initiation pour pouvoir être traduite ; chez les bactéries et les archaea, ce codon est AUG, plus rarement GUG ou UUG, tandis que chez les eucaryotes, il est uniquement AUG.

📌 Une ORF n’est pas équivalente à un gène : le gène comprend la CDS codant le produit protéique ainsi que les signaux associés à la transcription.

• Le séquençage de l’ADNc puis sa comparaison avec la séquence génomique permet d’identifier la CDS, les régions 5′ et 3′ des transcrits et la position des introns.

Compléments

• Les codons stop sont :

  • UAG
  • UGA
  • UAA

• Les codons d’initiation AUG, GUG et UUG sont toujours traduits en méthionine.

• Un gène eucaryote contient typiquement des exons et des introns définis par des sites d’épissage ; les exons situés aux extrémités peuvent inclure des régions non traduites impliquées dans la stabilité ou la régulation de la traduction de l’ARN.

• Le RNA-seq séquence les ADNc produits à partir de l’ARNm extrait d’un tissu ou d’un organisme et permet de détecter les régions chromosomiques transcrites dans une condition donnée.

• En RNA-seq, les reads alignés sur la séquence chromosomique correspondent aux exons et leur nombre dans une région sert à mesurer l’intensité de transcription de cette région.

📖 10. Prédiction fonctionnelle par homologie

🔑 Notions clés & Définitions

• Similitude de séquences : Présence, à des positions équivalentes, d’acides aminés appartenant à une même classe, comme les acides aminés chargés, polaires ou hydrophobes.

★ À maîtriser

• La fonction d’un CDS nouvellement identifié est prédite en comparant la séquence protéique déduite à des séquences de protéines connues, puis en examinant les alignements proposés par des algorithmes.

📌 L’homologie indique une origine évolutive commune et constitue une relation absolue, tandis que l’identité mesure la proportion de nucléotides ou d’acides aminés identiques aux mêmes positions.

📌 Une forte identité ou une conservation de séquence suggère une homologie et peut permettre de proposer, sans la démontrer, une fonction biochimique ou structurelle à une protéine inconnue.

Compléments

• Environ 20 % des séquences obtenues lors du séquençage systématique de Bacillus subtilis, Saccharomyces cerevisiae et Caenorhabditis elegans n’ont aucun équivalent connu.

💡 Astuce mémo

Séquence nouvelle → comparaison → fonction hypothétique

📖 11. Génomique comparative et évolution

★ À maîtriser

• Le génome humain contient environ 25 000 gènes, soit à peine cinq fois plus qu’une bactérie comme Escherichia coli ou que la levure.

• Le séquençage de génomes complets permet de comparer la présence ou l’absence de gènes, leur environnement génomique et la taille des familles de gènes afin d’établir des phylogénies génomiques comparées.

Compléments

• La séquence complète du génome de Saccharomyces cerevisiae a été obtenue en 1996 grâce à un effort international auquel la CEE a joué un rôle de pionnier.

• Une première ébauche de la séquence complète du génome humain a été proposée en 2000, puis une seconde en 2001.

📌 Le taux de substitution dans les régions traduites en protéines est à peu près proportionnel à l’ancienneté de la séparation des espèces comparées.

💡 Astuce mémo

Séquences conservées → comparaisons → phylogénies révisées

📖 12. Approches de la post-génomique

🔑 Notions clés & Définitions

• Transcriptome : Ensemble des ARN exprimés dans une condition donnée, dont le niveau peut être suivi par puces à ADN ou par RNA-seq.
• Biologie des systèmes : Combine des données génomiques, post-génomiques et phénotypiques pour modéliser le fonctionnement global de la cellule comme un système intégré.
• Protéome : Ensemble des protéines dont l’expression est étudiée simultanément dans diverses conditions.
• Interactome : Complexes protéiques stables ou transitoires qui se forment entre protéines dans une condition donnée.
• Métabolome : Ensemble des métabolites suivis simultanément dans une population de cellules à l’équilibre afin d’obtenir une signature de son état métabolique.

📝 Points essentiels

• La production d’un ARNm n’est pas équivalente à la production de la protéine correspondante.

📖 13. Mesures moléculaires et biologie des systèmes

★ À maîtriser

📌 Les profils RNA-seq mettent en évidence les changements du taux de transcription au cours du développement et distinguent les exons des introns éliminés par épissage.

• Pour identifier une protéine séparée par électrophorèse bidimensionnelle, on l’élue de la membrane, on la digère avec la trypsine, puis on mesure par spectrométrie de masse les masses des peptides obtenus et on les compare aux masses prédites à partir du génome annoté.

• Le défi de la biologie des systèmes est de développer des modèles capables d’intégrer les données issues de différents niveaux biologiques.

Compléments

• L’analyse RNA-seq de l’expression génique chez la drosophile représente le nombre de reads par base le long du chromosome et selon le stade de développement.

📖 14. Détection des mutations et marqueurs liés

★ À maîtriser

• La mutation Glu6Val du gène de la chaîne β de la globine, due au changement GAG - GTG, remplace l’acide glutamique par la valine en position 6 et détruit un site DdeI, ce qui permet de détecter le variant HbS associé à l’anémie falciforme.

• Des oligonucléotides synthétiques de 19 bases reproduisant la séquence normale ou mutante permettent de détecter une mutation par le changement de leur température de fusion (Tm) lors de l’hybridation.

📌 Les sondes A et B détectent directement une mutation, tandis que la sonde C détecte un polymorphisme situé sur le même chromosome et lié à la mutation étudiée.

Compléments

📌 La perte ou le gain d’un site de restriction ne peut pas toujours être associé directement à une mutation ponctuelle donnée.

• La mutation Glu342Lys de l’α1-antitrypsine produit une protéine qui n’inhibe plus l’élastase pulmonaire et prédispose les individus atteints à l’emphysème pulmonaire.

• La détection prénatale d’allèles mutés dans les familles à risque peut associer l’amplification par PCR de la région porteuse de la mutation à des sondes allèles spécifiques, à partir de l’ADN de cellules amniotiques.

• Des sondes de type cDNA utilisées en Southern blot d’ADN génomique ou en Northern blot d’ARN totaux peuvent révéler une délétion totale ou partielle d’un gène, ou une anomalie de maturation ou de stabilité des ARNm.

• Dans l’espèce humaine, la fréquence moyenne de recombinaison entre des séquences séparées de 1000 kb est de 1 %, de sorte que des polymorphismes proches peuvent être transmis comme des marqueurs très liés.

💡 Astuce mémo

Une faible recombinaison → des marqueurs proches co-ségrègent avec la mutation.

📖 15. Séquences répétées du génome eucaryote

🔑 Notions clés & Définitions

• Minisatellites : Les minisatellites sont des répétitions en tandem de courtes séquences de 5 à quelques dizaines de paires de bases, souvent situées près des gènes dans des régions non codantes.
• Microsatellites : Les microsatellites sont des répétitions en tandem de séquences de 2 à 4 pb, probablement générées par glissement et saut de la polymérase.

★ À maîtriser

• La taille des minisatellites varie fréquemment entre individus et modifie la taille des fragments de restriction qui les portent, ce qui permet d’établir une empreinte génétique utilisable notamment en médecine légale.

• Chez l’humain et les singes, les séquences Alu sont des SINE de 300 pb, répétées environ 5 × 10⁵ fois, et on en trouve en moyenne une tous les 5 à 6 kb.

Compléments

• Les séquences satellites sont des répétitions en tandem de 10 pb à plus de 1000 pb, présentes parfois plusieurs milliers de fois à certains loci hétérochromatiques, notamment les centromères et les télomères.

📌 L’amplification d’un microsatellite de 3 pb ne modifie pas la phase de lecture, mais la répétition de l’acide aminé correspondant peut provoquer des pathologies.

• Les SINE sont des séquences dispersées de moins de 500 bp ; dans le génome humain, elles comptent plus d’un million de copies et représentent environ 13 % de l’ADN total.

• Les LINE sont des séquences dispersées de 5 à 7 kb à l’état complet, mais souvent tronquées ; les seuls LINE-1 comptent environ 500 000 copies dans le génome humain.

• En Alu PCR, un oligonucléotide spécifique des motifs conservés d’Alu amplifie les régions où deux séquences Alu sont suffisamment proches et orientées de façon convenable, soit à moins de 5 ou 10 kpb l’une de l’autre.

• Les profils d’amplification obtenus par Alu PCR peuvent servir à typer des individus et à ordonner les clones d’une banque constituée à partir d’un individu donné.

• Le tableau des séquences répétées du génome humain indique 1 560 000 SINE couvrant 360 Mb (12 %), 870 000 LINE couvrant 560 Mb (19 %) et 440 000 rétrovirus couvrant 230 Mb (8 %).

• Chez les Poacées, les génomes varient de 250 à 15 000 Mb, principalement en raison des différences de quantité d’éléments transposables, alors que le contenu en gènes varie probablement peu.

💡 Astuce mémo

Tandem : répétitions côte à côte ; dispersées : copies réparties dans le génome.

📖 16. Séquences répétées du génome humain

★ À maîtriser

• Les séquences répétées présentées dans le tableau totalisent 1 230 Mb, soit 41 % du génome humain.

Compléments

• Les autres transposons mesurent de 100 pb à 3 kb et représentent 2 900 000 copies, soit 80 Mb et 3 % du génome humain.

📖 17. Définition et génotypage des SNP

🔑 Notions clés & Définitions

• SNP : Substitution de base présente chez au moins 1 % de la population humaine.

★ À maîtriser

• Les mutations ponctuelles à l’origine des SNP ségrègent de façon mendélienne, sont le plus souvent silencieuses et touchent les gènes comme les régions intergéniques.

• Le séquençage direct de régions génomiques chez plusieurs individus permet de repérer les substitutions à chaque site, puis d’évaluer la fréquence des allèles dans la population.

• Une puce à ADN porte, à des positions précises, des oligonucléotides de 25 nucléotides, avec deux à quatre oligonucléotides côte à côte pour représenter les allèles connus de chaque SNP analysé.

• Pour génotyper les SNP sur puce, les régions candidates sont amplifiées par PCR, marquées avec des nucléotides fluorescents puis hybridées ensemble à la puce; l’appariement aux oligonucléotides révèle le profil allélique de l’individu.

Compléments

• Entre chromosomes homologues quelconques chez l’humain, on attend en moyenne 0,5 à 10 substitutions par kb, tandis que deux individus quelconques sont globalement identiques à 99,9 %.

• Le projet 1000 Genomes, initié en 2007, a publié en 2015 une base de données en libre accès sur la variation génétique de 2 504 individus issus de 26 populations.

• Le projet 1000 Genomes a caractérisé plus de 88 millions de variants, dont 84,7 millions de SNP et 2,6 millions d’insertions ou délétions courtes (indels).

• Une puce permet d’analyser plusieurs milliers de polymorphismes en une seule hybridation, mais entraîne 11 à 21 % de faux positifs.

📖 18. Cartes génétiques et diagnostic médical

★ À maîtriser

📌 Les SNP sont très rarement la mutation qui cause directement une maladie; ils servent plutôt à repérer statistiquement des régions et des gènes associés à un caractère ou à une prédisposition.

• L’identification de SNP fréquemment associés à un caractère permet de rechercher des régions chromosomiques et des gènes liés à ce caractère en supposant que les mutations délétères ancestrales restent associées à des SNP plus anciens voisins.

• La fréquence de recombinaison varie fortement le long des chromosomes, et les SNP associés à un point chaud de recombinaison peuvent être inutilisables pour une analyse de liaison génétique.

• Un test d’association identifie une association statistique entre des variants génétiques et un caractère en comparant la distribution des SNP entre un groupe test et un groupe témoin.

Compléments

• Le projet international HapMap, fondé sur l’analyse de plusieurs millions de SNP chez 270 individus, a produit des cartes de SNP en 2005, 2007 et 2009.

• Le projet HapMap a regroupé des SNP présents chez au moins 1 % de la population mondiale.

• Chez l’humain, 1 % de recombinaison correspond en moyenne à 1 Mb, et deux crossing-over sont en moyenne séparés par 50 Mb.

• Le choix des groupes test et témoin est difficile, car des maladies aux signes cliniques similaires peuvent dépendre de mécanismes et de gènes différents.

💡 Astuce mémo

SNP associés → régions chromosomiques candidates → gènes potentiellement liés au caractère