Fiche de révision : Biologie moléculaire et PCR

📋 Plan du Cours

1. Structure et expression des gènes
2. Maturation des ARN eucaryotes
3. Extraction des acides nucléiques
4. Électrophorèse et quantification
5. Enzymes de restriction et ligases
6. Nucléases et polymérases
7. PCR classique et cinétique
8. Variantes et limites de la PCR

📖 1. Structure et expression des gènes

🔑 Notions clés & Définitions

• Gène : Séquence d’ADN comprenant une partie exprimée, qui est transcrite, et une partie permettant l’expression, appelée promoteur.

📝 Points essentiels

• Un nucléotide contient un sucre, une base et un phosphate ; les nucléotides libres sont triphosphates, tandis que ceux intégrés dans une molécule d’ADN sont monophosphates.

• Le promoteur contient des boîtes de séquence qui fixent des facteurs de transcription, permettant l’initiation de la transcription et le recrutement de l’ARN polymérase.

📌 Le brin transcrit, ou brin matrice antisens, est le brin inférieur orienté 3’→5’ et lu par l’ARN polymérase, tandis que le brin sens est le brin supérieur orienté 5’→3’.

💡 Astuce mémo

Brin matrice lu 3’→5’, brin sens orienté 5’→3’

📖 2. Maturation des ARN eucaryotes

★ À maîtriser

📌 Chez les procaryotes, la partie transcrite donne directement naissance à un ARN messager, tandis que chez les eucaryotes elle contient des introns et des exons et produit d’abord un ARN prémessager.

• 🔄 La maturation comprend trois phénomènes:

  1. Ajout d’une coiffe en 5’
  2. Ajout d’une queue poly A en 3’
  3. Excision des introns et épissage des exons

• Les introns commencent par un site donneur GT et finissent par un site accepteur AG ; la traduction commence par le codon AUG de la méthionine et se termine par UAA, UAG ou UGA.

Compléments

• La queue poly A comporte environ 1000 adénines et est associée à la boîte de polyadénylation AAUAAA.

💡 Astuce mémo

Coiffe 5’ → épissage → queue poly A 3’

📖 3. Extraction des acides nucléiques

★ À maîtriser

• 🔄 L’extraction comprend quatre étapes:
  1. Lyse
  2. Dénaturation ou dissociation des protéines
  3. Inactivation des nucléases
  4. Purification ou isolement des acides nucléiques

Compléments

• Les méthodes de lyse cellulaire comprennent: la lyse chimique avec un détergent comme le SDS, la lyse enzymatique avec le lysozyme, la lyse enzymatique avec la protéinase K

• Les acides nucléiques extraits sont purs à environ 60 %, car l’extraction laisse nécessairement des contaminants.

💡 Astuce mémo

Lyser → dénaturer → inhiber → purifier

📖 4. Électrophorèse et quantification

★ À maîtriser

• L’électrophorèse des acides nucléiques utilise principalement un gel d’agarose pour faire migrer des molécules d’ADN double brin selon leur taille en paires de bases.

• Les acides nucléiques absorbent les ultraviolets à 260 nm grâce à leurs bases hétérocycliques, tandis que les protéines absorbent à 280 nm grâce à leurs acides aminés aromatiques.

Compléments

📌 L’hyperchromie correspond au fait qu’un ADN double brin absorbe moins les ultraviolets qu’un ADN simple brin.

💡 Astuce mémo

Acides nucléiques à 260 nm, protéines à 280 nm

📖 5. Enzymes de restriction et ligases

🔑 Notions clés & Définitions

• Enzyme de restriction : Endonucléase qui coupe de façon définie et reproductible les liaisons phosphodiester à l’intérieur d’un ADN double brin en reconnaissant un motif palindromique.

★ À maîtriser

📌 Un isoschizomère reconnaît le même site et coupe de la même manière qu’une enzyme d’une autre origine, tandis qu’un néoschizomère reconnaît le même site mais coupe différemment.

• Les enzymes de restriction peuvent produire des bouts francs ou des bouts cohésifs, et deux enzymes sont compatibles si leurs extrémités peuvent être ligaturées.

Compléments

• Les enzymes de restriction proviennent notamment des bactéries et les protègent des bactériophages en coupant l’ADN phagique lors du phénomène de restriction.

💡 Astuce mémo

Bouts francs compatibles entre eux ; bouts cohésifs seulement si complémentaires

📖 6. Nucléases et polymérases

🔑 Notions clés & Définitions

• Taq polymérase : ADN polymérase ADN dépendante issue de Thermus aquaticus, qui synthétise l’ADN dans le sens 5’→3’ et possède aussi une activité exonucléasique 3’→5’.

📝 Points essentiels

📌 La DNAse I est une endonucléase qui coupe après un nucléotide à pyrimidine, sur un ADN simple ou double brin, pour éliminer les traces d’ADN lors de l’extraction d’ARN.

• La RNAse A coupe l’ARN simple ou double brin, tandis que la RNAse H dégrade l’ARN uniquement lorsqu’il est associé à une molécule d’ADN dans un hybride.

• La transcriptase inverse est une ADN polymérase ARN dépendante qui synthétise un ADN complémentaire à partir d’un brin d’ARN.

💡 Astuce mémo

La polymérase construit, la nucléase dégrade

📖 7. PCR classique et cinétique

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR : Réaction enzymatique qui amplifie un fragment d’ADN à partir d’un ADN matrice, de deux amorces, de Taq polymérase, de désoxyribonucléotides triphosphates et d’un tampon contenant notamment Mg2+.

★ À maîtriser

• 🔄 Chaque cycle comprend trois étapes:
  1. Dénaturation à 94 °C pendant 30 secondes
  2. Hybridation des amorces autour de 50 à 60 °C
  3. Polymérisation à 72 °C

📐 Formule — La quantité d’ADN après n cycles suit la relation $Q_n = Q_0 \times 2^n$ ou, avec un rendement r, $Q_n = Q_0(1+r)^n$.

Compléments

• Une PCR comporte généralement 30 cycles et dure environ 1 h 30.

💡 Astuce mémo

Dénaturation → hybridation → polymérisation

📖 8. Variantes et limites de la PCR

★ À maîtriser

• Les amorces de PCR sont des oligonucléotides d’environ 20 nucléotides, longueur considérée comme suffisamment spécifique d’un fragment dans un génome.

📐 Formule — La température de fusion des amorces est estimée par la relation $T_f = 4(G+C) + 2(A+T)$.

📌 La PCR est très sensible aux contaminations par tout ADN amplifiable, notamment les produits de PCR, ce qui impose une circulation de la salle pré-PCR vers la salle post-PCR sans retour en arrière.

📌 La RT-PCR commence par une rétrotranscription de l’ARN en ADN complémentaire, la PCR multiplex amplifie plusieurs fragments dans un même tube et la PCR quantitative suit la quantité de produit à chaque cycle.

• En PCR quantitative, le cycle seuil CT correspond à l’entrée dans la phase exponentielle lorsqu’un seuil commun de fluorescence est atteint, et moins l’échantillon contient de cibles initiales, plus le CT est élevé.

Compléments

• En PCR digitale, l’échantillon est compartimenté, par exemple en 20 000 compartiments à partir de 20 μL, afin d’obtenir des compartiments contenant zéro ou une molécule cible et d’estimer la quantité grâce à la loi de Poisson.

💡 Astuce mémo

PCR quantitative : seuil et CT ; PCR digitale : positif ou négatif

📊 Tableaux de synthèse

Principales enzymes de biologie moléculaire

Variantes de la PCR