Fiche de révision : Cellules souches embryonnaires

📋 Plan du Cours

1. Généticine et sélection cellulaire
2. Vecteurs de clonage et expression
3. Recombinaisons et ciblage génétique
4. Cellules ES et potentiel biologique
5. Production de souris transgéniques
6. Knock-out conditionnel Cre-LoxP
7. Applications humaines et réglementation
8. Culture et thérapie cellulaire
9. Cellules différenciées et neurales

📅 Repères chronologiques

1. 1981Martin Evans et Matthew Kaufman ont isolé et établi en culture des cellules pluripotentielles à partir d’embryons de souris. — Evans MJ, Kaufman MH, Establishment in culture of pluripotential cells from mouse embryos, 1981
2. 1986Robertson, Bradley, Kuehn et Evans ont obtenu la transmission germinale de gènes introduits dans des cellules pluripotentielles cultivées au moyen d’un vecteur rétroviral. — Robertson E, Bradley A, Kuehn M, Evans M, Germ-line transmission of genes introduced into cultured pluripotential cells by retroviral vector, 1986
3. 6 août 2004La loi française de bioéthique autorise sous conditions l’utilisation d’embryons surnuméraires et interdit la création d’embryons humains par clonage à des fins thérapeutiques ou de recherche.
4. 2007Mario Capecchi, Oliver Smithies et Martin Evans ont reçu le prix Nobel de médecine pour la mise au point du ciblage de gènes par recombinaison homologue et de l’inactivation ciblée des gènes.

📖 1. Généticine et sélection cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Généticine : Antibiotique aminoglycoside produit par la bactérie Micromonospora rhodorangea qui inhibe la synthèse protéique dans les cellules procaryotes et eucaryotes.

★ À maîtriser

📌 Le gène neo du transposon Tn5 confère la résistance à la généticine en codant une aminoside 3'-phosphotransférase, ce qui permet de sélectionner les cellules génétiquement modifiées porteuses de ce gène.

Compléments

📌 La néomycine et la gentamicine sont des aminoglycosides proches de la généticine, mais la généticine est principalement utilisée en biologie moléculaire alors que les deux autres sont utilisées chez l’être humain.

💡 Astuce mémo

Gène neo → APT → résistance à la généticine

📖 2. Vecteurs de clonage et expression

🔑 Notions clés & Définitions

• Vecteur d’expression : Contient des éléments permettant l’expression d’un gène dans une cellule animale et sa multiplication ainsi que sa sélection dans un hôte bactérien.

📝 Points essentiels

• Les vecteurs de clonage contiennent notamment: une taille de quelques kilobases, un site d’insertion appelé polylinker, une origine de réplication ORI, un gène de résistance aux antibiotiques comme ampR

• Dans le vecteur d’expression décrit, le promoteur SV40 permet l’expression dans une cellule animale, le RBS favorise la traduction, la séquence polyA SV40 augmente la durée de vie de l’ARN messager et le gène Neo sélectionne les cellules transfectées de façon stable.

📖 3. Recombinaisons et ciblage génétique

🔑 Notions clés & Définitions

• Recombinaison homologue : Mécanisme d’échange de fragments d’ADN entre deux molécules présentant des séquences identiques ou très similaires.

★ À maîtriser

• 🔄 La NHEJ répare une cassure double brin en:
  1. reconnaissant les deux extrémités coupées
  2. les raboutant directement
  3. réparant sans utiliser de matrice

📌 La double sélection identifie les bactéries ayant récupéré un vecteur grâce à la résistance à l’ampicilline et les vecteurs recombinants grâce à une β-galactosidase négative due à la mutation du gène lacZ.

Compléments

📌 Le ganciclovir devient toxique après trois phosphorylations, dont une réalisée par l’enzyme virale HSV-TK, ce qui permet d’éliminer sélectivement les cellules TK+ lors de la sélection négative.

💡 Astuce mémo

Homologue = ciblée ; NHEJ = raboutage direct

📖 4. Cellules ES et potentiel biologique

🔑 Notions clés & Définitions

• Cellules ES : Cellules pluripotentes issues de la masse cellulaire interne du blastocyste.

★ À maîtriser

• Les cellules ES peuvent produire les trois feuillets primitifs:
  • l’ectoderme
  • le mésoderme
  • l’endoderme

📌 La greffe de cellules ES dans une souris adulte produit un tératocarcinome composé de cellules ES pluripotentes et de cellules différenciées représentant les trois feuillets embryonnaires.

Compléments

• Les cellules matures produites peuvent être:
  • des neurones
  • des cardiomyocytes
  • des cellules β pancréatiques

💡 Astuce mémo

Blastocyste → trois feuillets → cellules matures

📖 5. Production de souris transgéniques

🔑 Notions clés & Définitions

• Knock-in : Intégration ciblée d’un transgène dans le génome hôte par recombinaison homologue.
• Knock-out : Invalidation ciblée d’un gène par modification génétique des cellules ES.

📝 Points essentiels

• 🔄 La production de souris transgéniques suit quatre étapes:
  1. modifier génétiquement les cellules ES d’un embryon donneur
  2. injecter les cellules ES dans la cavité d’un embryon receveur et réimplanter l’embryon
  3. croiser les souris mosaïques avec des souris sauvages pour obtenir des hétérozygotes
  4. obtenir des souris homozygotes

📌 La transgénèse classique par injection dans le zygote peut conduire à un transgène présent dans toutes les cellules des animaux F1, tandis que l’utilisation de cellules ES produit d’abord des souris chimères portant le transgène dans certaines cellules.

💡 Astuce mémo

ES modifiées → blastocyste → chimères → F2 homozygotes

📖 6. Knock-out conditionnel Cre-LoxP

🔑 Notions clés & Définitions

• Knock-out conditionnel : Permet d’inactiver un gène dans un organe donné ou à un moment donné afin d’étudier des fonctions qui seraient masquées par une invalidation précoce et globale.

📝 Points essentiels

📌 La recombinase Cre provoque une recombinaison entre deux sites LoxP de 34 paires de bases placés de part et d’autre du gène à supprimer.

• Pour obtenir une inactivation conditionnelle, le gène entouré par des sites LoxP est associé à une recombinase Cre exprimée sous le contrôle d’un promoteur spécifique d’un tissu ou d’une phase du développement.

💡 Astuce mémo

KO constitutif = partout et toujours ; KO conditionnel = tissu et moment ciblés

📖 7. Applications humaines et réglementation

★ À maîtriser

• Chez l’être humain, les cellules ES peuvent être obtenues à partir d’embryons surnuméraires issus d’une assistance médicale à la procréation, après prélèvement de cellules du bouton embryonnaire au stade blastocyste.

📌 En France, la recherche sur les cellules ES est autorisée mais strictement encadrée par l’Agence de la biomédecine et nécessite notamment un consentement écrit confirmé après un délai de réflexion de trois mois.

Compléments

• Le clonage thérapeutique consiste à retirer le noyau d’un ovocyte, à le remplacer par le noyau d’une cellule spécialisée du patient, à stimuler l’ovocyte par une décharge électrique, puis à isoler des cellules ES du blastocyste obtenu.

💡 Astuce mémo

Embryon surnuméraire autorisé ; clonage thérapeutique interdit

📖 8. Culture et thérapie cellulaire

★ À maîtriser

• Les cellules ES sont prélevées sur des blastocystes âgés de 5 à 7 jours après la fécondation in vitro, mises en culture dans des conditions adaptées, puis différenciées par modification du milieu de culture.

• Les cellules ES humaines permettent notamment: d’étudier le développement normal ou pathologique, de modéliser des maladies génétiques rares, d’étudier les cellules d’organes et leurs maladies, de produire des cellules spécialisées pour la thérapie cellulaire

📌 Une greffe autologue utilise les cellules du patient et est parfaitement tolérée sur le plan immunitaire, tandis qu’une greffe allogène utilise les cellules d’un autre donneur et peut provoquer des problèmes de compatibilité.

📌 Une cellule ES restée indifférenciée après implantation peut se renouveler indéfiniment et provoquer un cancer, ce qui impose de contrôler l’homogénéité et la stabilité de la différenciation.

Compléments

• Les applications étudiées concernent: les cellules de la rétine contre la DMLA, les kératinocytes contre des ulcères cutanés, les cellules cardiaques, les cellules pancréatiques productrices d’insuline, les cellules neurales

• À partir de 750 000 cellules ES décongelées, il est possible de produire une banque de 325 millions de kératinocytes en quatre mois, alors qu’environ 500 000 kératinocytes sont nécessaires pour traiter un patient.

💡 Astuce mémo

Milieu spécifique → différenciation → cellule thérapeutique

📖 9. Cellules différenciées et neurales

🔑 Notions clés & Définitions

• Cellules induites différenciées : Obtenues directement à partir d’une cellule différenciée sans passer par l’étape cellule souche, selon un processus appelé transdifférenciation.
• Cellules souches neurales : Cellules multipotentes capables de s’autorenouveler et de produire notamment des neurones, des astrocytes et des oligodendrocytes.
• Quiescence : État d’inactivité dans lequel les cellules souches neurales ne prolifèrent pas et ne génèrent pas de nouvelles cellules jusqu’à leur activation.

★ À maîtriser

• Chez les mammifères, les deux régions cérébrales connues pour maintenir des cellules souches neurales adultes sont la zone sous-ventriculaire, dont les précurseurs migrent vers le bulbe olfactif, et le gyrus denté de l’hippocampe, impliqué dans la mémorisation.

Compléments

• Des cellules exocrines du pancréas ont été transformées in vivo en cellules β par l’expression des facteurs de transcription Ngn3, Pdx1 et Mafa.

• Les cellules souches neurales quiescentes G2 présentent un potentiel régénérateur élevé et le gène tribbles régule sélectivement ces cellules chez la drosophile.

💡 Astuce mémo

CiD : transdifférenciation directe ; cellule neurale : potentiel neural restreint

📊 Tableaux de synthèse

Types de recombinaison génétique

Voies d’obtention des cellules ES humaines