Fiche de révision : Chromatographie liquide haute performance

📋 Plan du Cours

1. Histoire et définition de la chromatographie
2. Principes fondamentaux de séparation
3. Systèmes et techniques chromatographiques
4. Rétention et distribution des solutés
5. Efficacité et résolution chromatographiques
6. Élargissement des pics et Van Deemter
7. Interactions moléculaires en chromatographie
8. Particularités et chaîne CLHP
9. Efficacité et rétention chromatographiques
10. Propriétés et choix des solvants
11. Chromatographie d’adsorption
12. Phases greffées et phases inversées
13. Échange d’ions et calcul chromatographique
14. Échange d’ions et phases stationnaires
15. Équation de Van Deemter
16. Paramètres chromatographiques
17. Polarité et phases inversées
18. Choix du solvant et élution

📅 Repères chronologiques

1. 1950La chromatographie en phase gazeuse apparut.
2. 1967La chromatographie liquide à haute pression a été mise au point par Hucker et Hulsman
3. 1969La chromatographie en phase liquide se développa véritablement après le 5e Symposium International « Advances in Chromatography ».

📖 1. Histoire et définition de la chromatographie

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie : Regroupe les techniques de séparation non destructives de substances en solution par passage au travers d’un matériau sélectif.

📝 Points essentiels

• Tswett, botaniste russe, sépara dans les années 1900 des pigments de plantes vertes sur une colonne de craie finement pulvérisée contenant du CaCO3.

💡 Astuce mémo

Tswett et les pigments → CPG → exclusion → CPL moderne

📖 2. Principes fondamentaux de séparation

🔑 Notions clés & Définitions

• Phase stationnaire : La phase fixe, solide ou liquide, avec laquelle les solutés interagissent pendant leur migration chromatographique.
• Phase mobile : Une phase liquide ou gazeuse continue qui entraîne les solutés au contact de la phase stationnaire.

📝 Points essentiels

• La séparation chromatographique repose sur la répartition différente des solutés entre une phase stationnaire et une phase mobile non miscibles, selon leurs propriétés physico-chimiques.

• Un soluté ayant une forte affinité pour la phase mobile et une faible affinité pour la phase stationnaire possède le plus petit temps de rétention et sort le premier.

💡 Astuce mémo

Une course de canoës : les solutés avancent plus ou moins vite entre les rochers de la phase stationnaire.

📖 3. Systèmes et techniques chromatographiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie d’exclusion : Sépare les molécules selon leur capacité à pénétrer dans les pores d’un solide : les molécules trop grosses sont entraînées rapidement, tandis que les autres sont retenues plus longtemps.

★ À maîtriser

• Les principales interactions sont:
  • Adsorption
  • Partage
  • Échange d’ions
  • Exclusion

📌 La CPG concerne les solutés gazeux ou vaporisables sans décomposition, généralement de masse moléculaire inférieure à 1000, tandis que la CPL couvre des masses moléculaires comprises entre 100 et 10⁷.

📌 La chromatographie sur couche mince sert essentiellement à l’analyse qualitative, tandis que la chromatographie liquide haute performance permet l’identification et la quantification des constituants.

• Une chaîne HPLC comprend principalement:
  • Réservoir d’éluant
  • Pompe à piston
  • Système d’injection
  • Colonne
  • Détecteur couplé à un intégrateur

📌 En HPLC, le mode isocratique utilise un même éluant pendant toute l’analyse, tandis que le mode gradient fait varier la concentration des constituants de l’éluant.

Compléments

• En chromatographie sur couche mince, l’échantillon est déposé sur une ligne, le solvant monte par capillarité, puis la plaque est séchée et les constituants sont détectés par fluorescence ou révélation.

💡 Astuce mémo

CCM identifie surtout ; HPLC identifie, dose et peut préparer.

📖 4. Rétention et distribution des solutés

🔑 Notions clés & Définitions

• Temps de rétention : Le temps nécessaire pour qu’un composé parcoure toute la colonne chromatographique.
• Coefficient de partage : Décrit la répartition à l’équilibre d’un composé soluble dans deux phases non miscibles.

📝 Points essentiels

📐 Formule — Le temps de rétention réduit vérifie $t'_R=t_R-t_m$.

📐 Formule — Le facteur de capacité vérifie $k'=K\frac{V_F}{V_0}=\frac{V'_R}{V_0}$ et le volume de rétention vérifie $V_R=V_0+KV_F$.

📌 Le facteur de sélectivité entre les solutés A et B vérifie $\alpha=\frac{K_A}{K_B}=\frac{k'_A}{k'_B}=\frac{V'_{RA}}{V'_{RB}}$ ; si α = 1, aucune séparation n’est possible.

💡 Astuce mémo

Affinité pour la phase stationnaire → rétention accrue → temps de sortie plus long

📖 5. Efficacité et résolution chromatographiques

★ À maîtriser

📐 Formule — Le nombre de plateaux théoriques vérifie $N=\left(\frac{t_R}{\sigma}\right)^2=16\left(\frac{t_R}{\omega}\right)^2$.

📐 Formule — La résolution entre deux pics vérifie $R_S=\frac{2(t'_{R B}-t'_{R A})}{\omega_A+\omega_B}$ ; lorsque RS = 1, le recouvrement des pics est de 2 %.

Compléments

📐 Formule — La hauteur équivalente à un plateau théorique vérifie $H=\frac{L_c}{N}$.

📐 Formule — La variance totale est la somme des variances indépendantes : $\sigma^2_{total}=\sigma^2_{injection}+\sigma^2_{détecteur}+\sigma^2_{colonne}+\sigma^2_{enregistreur}$.

💡 Astuce mémo

Un pic étroit traduit une grande efficacité ; un pic large traduit une dispersion accrue.

📖 6. Élargissement des pics et Van Deemter

★ À maîtriser

📐 Formule — L’équation de Van Deemter relie la HEPT H à la vitesse linéaire moyenne u : $H=A+\frac{B}{\bar{u}}+(C_S+C_M)\bar{u}$.

• L’élargissement d’une bande de soluté provient de la diffusion longitudinale, des chemins multiples dans le remplissage et de la résistance au transfert de masse.

• La courbe de Van Deemter met en évidence une vitesse optimale de la phase mobile pour laquelle la HEPT H est minimale.

Compléments

📐 Formule — Le terme d’Eddy est donné par $A=2\lambda d_p$, où dp est le diamètre des particules et λ le facteur d’irrégularité du remplissage.

📐 Formule — La diffusion longitudinale vérifie $B=2\gamma D_M$, avec γ = 0,6 pour une colonne remplie et γ = 1 pour une colonne capillaire.

💡 Astuce mémo

A-B-C : chemins multiples, diffusion longitudinale, transfert de masse

📖 7. Interactions moléculaires en chromatographie

★ À maîtriser

📐 Formule — L’énergie potentielle d’interaction entre deux charges dans un milieu vérifie $E=\frac{q q'}{4\pi\varepsilon_m r}$, et la force vérifie $F=\frac{q q'}{4\pi\varepsilon_m r^2}$.

• Les interactions de Van der Waals sont:

  • Dipôle permanent-dipôle permanent
  • Dipôle permanent-dipôle induit
  • Dipôle induit-dipôle induit

• Les liaisons hydrogène sont des interactions électrostatiques fortes, avec des énergies de -12 à -33 kJ·mol⁻¹ pour O···H et de -12 à -20 kJ·mol⁻¹ pour N···H.

Compléments

📐 Formule — Le potentiel de Mie des interactions entre atomes non liés vérifie $V_T=-\frac{A}{r^6}+\frac{B}{r^{12}}$.

📌 L’intensité relative des interactions augmente des interactions dipôle induit-dipôle induit à la liaison hydrogène, puis aux liaisons ionique et covalente.

💡 Astuce mémo

Charge-charge → charge-dipôle → dipôle-dipôle → interactions induites → liaison hydrogène

📖 8. Particularités et chaîne CLHP

★ À maîtriser

📌 La CPG est limitée aux composés volatils, tandis que la CLHP peut être utilisée pour des composés de grande masse moléculaire.

• Une chaîne de CLHP comprend principalement:
  • un réservoir d’éluant
  • une pompe
  • un injecteur
  • une colonne
  • un détecteur
  • un système d’acquisition

📌 La CLHP peut fonctionner en mode isocratique avec un même éluant pendant toute l’analyse ou en mode gradient avec une variation de la composition de l’éluant.

• Les colonnes de CLHP utilisent des particules de 3 à 10 μm, une surface spécifique de 100 à 500 m2/g et des pressions de travail pouvant atteindre environ 300 bars.

• Le détecteur UV mesure l’absorption de la lumière par les composés à la sortie de la colonne, et un détecteur à barrette de diodes enregistre simultanément un spectre UV-visible.

Compléments

• Les colonnes de CLHP sont généralement en inox ou en verre, avec un diamètre de 4 à 20 mm et une longueur de 15 à 30 cm.

📌 Un détecteur UV est utilisable si le composé absorbe à une longueur d’onde accessible et si la phase mobile n’absorbe pas à la longueur d’onde choisie.

• La lampe au deutérium est utilisée pour des longueurs d’onde comprises entre 190 et 350 nm.

📌 En LC-MS, les ions primaires sont fragmentés par dissociation induite par collision, tandis qu’en LC-MSn un ion peut être isolé puis fragmenté dans un ion-trap ou un triple quadripôle.

💡 Astuce mémo

Éluant → pompe → injecteur → colonne → détecteur

📖 9. Efficacité et rétention chromatographiques

★ À maîtriser

• En CLHP, les termes de résistance au transfert de masse C_S et C_M sont prépondérants et représentent environ 75 % du HEPT.

📐 Formule — Le facteur de capacité vérifie $k'=\frac{V_R-V_M}{V_M}=K\frac{V_S}{V_M}$.

📌 La résolution dépend de la sélectivité α, du facteur de capacité k’ et de l’efficacité N, qui correspondent respectivement à des contributions thermodynamiques, hydrodynamiques et mixtes.

📌 Pour obtenir une résolution favorable, il est recommandé de choisir un facteur de capacité k’ compris entre 2 et 10.

Compléments

• Le terme A représente généralement 10 à 15 % du HEPT, tandis que le terme B représente moins de 10 %, souvent environ 1 %.

💡 Astuce mémo

Petites particules et faible diffusion → échanges plus rapides → meilleure efficacité

📖 10. Propriétés et choix des solvants

🔑 Notions clés & Définitions

• Phase mobile : Solvant ou mélange de solvants qui transporte les composés vers la sortie de la colonne.

★ À maîtriser

• Un solvant de CLHP doit:
  • avoir une faible viscosité
  • être compatible avec le détecteur
  • être pur
  • être relativement sûr
  • dissoudre l’échantillon

📌 Les solvants protiques possèdent une fonction donneuse de protons, les solvants dipolaires aprotiques ont un moment dipolaire important sans proton acide, et les solvants aprotiques apolaires ont un faible moment dipolaire sans proton acide.

📐 Formule — Pour un mélange de solvants, la force totale vérifie $S_T=\sum_i S_i f_i$, où f_i est la fraction volumique du solvant i.

Compléments

• 🔄 La solubilisation comprend:

  1. la création d’une cavité dans le solvant
  2. la séparation des molécules du soluté
  3. l’insertion du soluté dans la cavité
  4. l’augmentation du désordre par mélange

• En chromatographie, la polarité s’exprime notamment par la force éluante εo, la polarité de Rohrschneider P’ ou le paramètre de solubilité de Hildebrand.

💡 Astuce mémo

Solvant protique donneur de proton, aprotique dépourvu de proton acide

📖 11. Chromatographie d’adsorption

🔑 Notions clés & Définitions

• Adsorption : Phénomène de surface dans lequel des molécules se fixent sur un solide adsorbant, généralement par des interactions faibles de type Van der Waals.

★ À maîtriser

• Le gel de silice possède des groupements silanol et siloxane responsables de ses interactions avec les solutés.

📌 Les gels de silice activés retiennent fortement les molécules polaires capables de former des liaisons hydrogène, tandis que l’ajout d’eau ou d’alcool les désactive.

• L’affinité croissante des solutés pour la silice suit l’ordre:

  • alcanes
  • composés éthyléniques
  • aromatiques
  • halogénures d’alkyle
  • éthers
  • composés nitrés
  • esters
  • cétones
  • alcools
  • amides et acides carboxyliques

• Dans le modèle de Snyder, plus la force éluante εo est grande, plus le facteur de capacité k’ est faible.

Compléments

📌 La silice n’est pas stable à un pH supérieur à 8, ולכן la phase mobile utilisée avec une colonne de silice doit avoir un pH inférieur à 8.

💡 Astuce mémo

Polarité accrue du soluté → adsorption plus forte sur la silice → rétention accrue

📖 12. Phases greffées et phases inversées

🔑 Notions clés & Définitions

• Phase greffée : Phase stationnaire constituée de motifs organiques fixés par liaison covalente sur un support rigide, généralement de la silice.

★ À maîtriser

📌 Les phases greffées polaires sont utilisées en phase normale avec des solvants peu polaires, tandis que les phases greffées apolaires sont utilisées en phase inverse avec des solvants polaires.

• En chromatographie en phase inverse, les supports les plus courants portent un greffage octadécylsilane, appelé ODS, C18 ou RP18.

📌 En phase inverse, l’eau est le solvant le moins éluant et l’ajout de méthanol ou d’acétonitrile augmente la force éluante.

Compléments

• Les phases greffées sont stables entre pH 2 et pH 7 et à des températures inférieures à 80 °C.

• En phase inverse, la rétention augmente avec la surface hydrocarbonée du soluté et avec la longueur du greffon selon l’ordre C2 < C8 < C18.

💡 Astuce mémo

Phase normale polaire avec éluant peu polaire, phase inverse apolaire avec éluant polaire

📖 13. Échange d’ions et calcul chromatographique

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie d’échange d’ions : Séparation des solutés ionisés ou ionisables grâce à l’échange d’ions mobiles avec des ions de charge opposée associés à des groupements fixes de la phase stationnaire.

★ À maîtriser

📐 Formule — Le nombre de plateaux théoriques est calculé à partir de la hauteur équivalente par $N=\frac{L}{H}$.

Compléments

• Les supports peuvent être:
  • la silice
  • les résines polystyréniques
  • la cellulose
  • le dextrane

📖 14. Échange d’ions et phases stationnaires

🔑 Notions clés & Définitions

• Échange d’ions : L’échange d’ions repose sur l’échange réversible des ions retenus près de charges fixes avec les ions de la phase mobile et s’applique uniquement aux solutés ionisés ou ionisables.

★ À maîtriser

• La phase stationnaire d’une chromatographie d’échange d’ions est constituée d’une matrice insoluble dans l’eau, en silice ou en polymère, portant des groupements fonctionnels ionisables.

Compléments

• Les supports peuvent être:
  • la silice
  • une résine polystyrénique
  • la cellulose
  • le dextrane

💡 Astuce mémo

Charges fixes → échange d’ions → séparation des solutés ionisés

📖 15. Équation de Van Deemter

★ À maîtriser

📐 Formule — L’équation de Van Deemter relie la hauteur équivalente à un plateau théorique à la vitesse linéaire selon $H = A + \frac{B}{u} + (C_s + C_m)u$.

• Le terme A de l’équation de Van Deemter correspond à la diffusion en milieu poreux, ou terme d’Eddy, due aux inégalités de vitesse entre les canaux et aux irrégularités de remplissage.

Compléments

• Le terme B correspond à la diffusion longitudinale, qui devient importante à faible vitesse car les analytes disposent de davantage de temps pour diffuser.

• Les termes Cs et Cm représentent la résistance au transfert de masse dans la phase stationnaire et dans la phase mobile, respectivement.

• En chromatographie en phase gazeuse, la résistance au transfert de masse est négligeable dans le gaz, tandis qu’en HPLC la pression peut devenir importante.

💡 Astuce mémo

A disperse entre les chemins, B diffuse dans le temps, C ralentit le transfert

📖 16. Paramètres chromatographiques

★ À maîtriser

📐 Formule — Le nombre de plateaux théoriques se calcule avec la largeur à la base selon $N = 16\left(\frac{t_R}{w}\right)^2$, et la hauteur équivalente à un plateau théorique selon $H = \frac{L}{N}$.

📐 Formule — Le volume de rétention est obtenu par $V_R = t_R \times D$ et le volume de rétention ajusté par $V'_R = V_R - V_M$, où D est le débit et VM le volume mort.

📐 Formule — Le facteur de capacité est défini par $k' = \frac{V_R - V_M}{V_M} = \frac{V'_R}{V_M}$.

Compléments

• Dans l’exemple fourni, un débit de 15 mL/min et un volume mort de 16,8 mL donnent un temps mort de 1,12 min.

📖 17. Polarité et phases inversées

🔑 Notions clés & Définitions

• Polarité : Répartition inégale des charges électriques dans une liaison ou une molécule, qui possède alors un moment dipolaire permanent avec une zone partiellement positive et une zone partiellement négative.

★ À maîtriser

• La polarité dépend principalement: de la différence d’électronégativité entre les atomes, de la géométrie moléculaire, de la capacité du solvant à établir des interactions dipôle-dipôle, des liaisons hydrogène ou des interactions

📌 En phase inverse sur une silice greffée alkyle, les analytes sont retenus par des interactions hydrophobes et une diminution du pourcentage de méthanol dans le mélange eau-méthanol augmente les temps de rétention.

📌 Une silice greffée aminopropyle peut fonctionner en phase normale ou en phase inverse selon les analytes et la phase mobile.

Compléments

• L’eau est très polaire, l’hexane est apolaire et le benzène est peu polaire mais très polarisable.

• La constante diélectrique mesure notamment la capacité d’un solvant à stabiliser les charges et les espèces ioniques, et plus elle est grande plus cette stabilisation est importante.

• L’indice de polarité de Snyder est fondé sur la force des interactions entre le solvant, le soluté et une phase stationnaire de référence.

💡 Astuce mémo

Phase normale : les composés polaires sont mieux retenus ; phase inverse : les composés hydrophobes le sont

📖 18. Choix du solvant et élution

★ À maîtriser

📌 Dans une phase normale sur silice non greffée, les composés les plus polaires sont les mieux retenus et sont décrochés par un solvant capable d’interactions dipôle-dipôle, comme l’isopropanol.

Compléments

📌 Pour augmenter les temps de rétention en phase normale, il faut diminuer la proportion du solvant qui interagit avec la phase stationnaire et décroche les analytes.

• Pour remplacer le dichlorométhane par le 1,2-dichloroéthane tout en conservant un indice de polarité global de 4,3, le mélange calculé contient 88 % d’hexane et 12 % de 1,2-dichloroéthane.

📌 Pour des raisons de sécurité, l’heptane est choisi plutôt que l’hexane car son indice de polarité est similaire, tandis que l’hexane possède une VIE de 50 ppm et est plus toxique.

💡 Astuce mémo

Solvant plus interactif avec la phase stationnaire → analytes moins retenus → élution plus rapide

📊 Tableaux de synthèse

Principaux modes de chromatographie

Phase normale et phase inverse