Fiche de révision : Chromatographie liquide haute performance

📋 Plan du Cours

1. Choix des techniques de chromatographie liquide
2. Pression et préparation de la phase mobile
3. Pompes et programmation des solvants
4. Injection et échantillonnage automatique
5. Colonnes et phases stationnaires
6. Phase mobile et élution
7. Détection par absorption et fluorescence
8. Détection réfractométrique et conductimétrique
9. Spectrométrie de masse et chromatogrammes
10. Quantification des acides du raisin

📖 1. Choix des techniques de chromatographie liquide

★ À maîtriser

• La chromatographie liquide comprend :
  • l’adsorption
  • le partage
  • l’échange d’ions
  • l’exclusion stérique

📌 L’adsorption ou le partage convient principalement à l’analyse de composés organiques de faible masse moléculaire, tandis que l’échange d’ions convient surtout aux ions minéraux ou organiques en solution aqueuse.

📌 L’exclusion stérique sépare les macromolécules selon leur taille, donc leur masse moléculaire, et s’applique approximativement lorsque leur masse moléculaire dépasse 1000.

Compléments

📌 L’exclusion stérique est appelée perméation de gel en solution organique et filtration sur gel en solution aqueuse.

• Le terme HPLC désigne les chromatographies liquides à haute performance correspondant aux deux premiers types, l’adsorption et le partage.

📖 2. Pression et préparation de la phase mobile

★ À maîtriser

• La réduction du diamètre des particules de support, passé d’environ 100 à 200 µm initialement à 3 à 10 µm, a accru l’efficacité des colonnes et nécessité des pressions plus élevées.

• En HPLC, une colonne de quelques centimètres nécessite environ 100 bars pour obtenir une vitesse de phase mobile comprise entre 0,1 et 1 cm/s.

📌 Les pressions en tête de colonne en chromatographie gazeuse sont 100 à 500 fois plus faibles qu’en HPLC en raison de la viscosité plus élevée de la phase mobile liquide et de la perte de charge associée.

Compléments

📐 Formule - La loi de Darcy relie la vitesse de la phase mobile à la différence de pression, à la viscosité, à la longueur de colonne, au diamètre des particules et au facteur de résistance à l’écoulement : $u=\frac{d_p^2\Delta P}{\Phi L\eta}$.

• La viscosité de l’eau est de 1 mPa·s, tandis que celle de l’hydrogène est de 8,7 × 10⁻³ mPa·s.

• Les moyens d’élimination comprennent :

  • le dégazage sous vide
  • le chauffage
  • l’agitation
  • la filtration
  • le barbotage de gaz inerte

💡 Astuce mémo

Phase mobile visqueuse → perte de charge → pression élevée

📖 3. Pompes et programmation des solvants

★ À maîtriser

📌 En régime isocratique, la composition de la phase mobile reste constante, tandis qu’en gradient d’élution, elle varie par programmation des solvants.

📌 Les pompes HPLC doivent résister à la corrosion, fournir des pressions pouvant atteindre 400 bars et délivrer un débit constant de 0,1 à 10 mL/min contrôlé à mieux que 0,5 %.

• Dans une pompe à deux cylindres déphasés, un cylindre aspire pendant que l’autre refoule la phase mobile vers la colonne, puis leurs rôles s’inversent, tandis qu’un amortisseur réduit les pulsations.

Compléments

• Les gaz dissous tels que N₂, O₂ et CO₂ modifient la compressibilité des éluants, l’oxygène réduit la durée de vie de la colonne et ces gaz gênent les détecteurs électrochimiques et spectrophotométriques.

• Une pompe quaternaire à chambre de mélange basse pression permet de mélanger quatre solvants.

• Le volume de course d’une pompe HPLC est compris entre 20 et 100 µL, et une course réduite diminue les fluctuations de pression tandis qu’une course plus élevée est requise pour les débits élevés.

📖 4. Injection et échantillonnage automatique

★ À maîtriser

• Un injecteur à boucle fonctionne en deux positions : en mode « load », la boucle se remplit avec l’échantillon, puis en mode « inject », l’échantillon est envoyé vers la colonne.

📌 L’injecteur à boucle permet des injections répétées reproductibles, ne comporte pas de septum et supporte des pressions supérieures à 5000 psi, mais son volume fixe impose de changer de boucle pour modifier le volume injecté.

Compléments

• Les passeurs automatiques placent les flacons sur un carrousel de 48 ou 96 positions et sont programmables pour le volume d’injection et le temps d’analyse.

• Le volume d’injection des injecteurs à boucle variable est généralement compris entre 0,1 et 100 µL.

📌 La précision décrit la reproductibilité des volumes injectés, l’exactitude décrit leur valeur absolue et la linéarité décrit la proportionnalité entre les volumes réellement injectés et les volumes programmés sur une plage de volumes.

📌 Le rinçage de l’aiguille réduit l’effet mémoire dû aux composés provenant d’une analyse précédente.

📖 5. Colonnes et phases stationnaires

★ À maîtriser

• Les colonnes HPLC décrites sont des tubes en acier inoxydable de 3 à 25 cm de longueur et de 1 à 5 mm de diamètre interne, garnis de particules de 3 à 10 µm.

📌 En mode normal, la phase stationnaire est polaire et les groupements cités comprennent amino, diol et cyano.

• Les groupements cités en mode inversé sont :
  • méthyle (–CH₃)
  • octyle (–(CH₂)₇–CH₃)
  • phényle (–C₆H₅)
  • octadécyle (–(CH₂)₁₇–CH₃)

Compléments

• Les supports de colonne développent une surface spécifique de 100 à 500 m²/g, avec une hauteur équivalente à un plateau théorique d’environ 10⁻² mm et un nombre de plateaux de 2000 à 25000.

• Environ 75 % des applications HPLC utilisent le mode inversé.

• La porosité des particules correspond à 30 à 70 % du volume libre de la colonne.

💡 Astuce mémo

Phase polaire en mode normal, phase apolaire en mode inversé

📖 6. Phase mobile et élution

★ À maîtriser

• En mode normal, la phase stationnaire et l’analyte sont plutôt polaires, tandis que la phase mobile est peu polaire, par exemple l’éther éthylique, le chloroforme ou l’hexane.

• En mode inversé, l’analyte et la phase stationnaire sont plutôt peu polaires, tandis que la phase mobile est polaire, par exemple l’eau, le méthanol, l’acétonitrile ou le THF.

• L’élution isocratique conserve la composition de la phase mobile et convient mieux aux séparations simples, tandis que le gradient modifie cette composition et convient mieux aux échantillons complexes.

Compléments

• La polarité des solvants est présentée dans l’ordre croissant suivant : hydrocarbures aliphatiques, oléfines, hydrocarbures aromatiques, halogénures, sulfures, éthers, nitrodérivés, esters, aldéhydes, cétones, alcools, amines, sulfones, sulfoxydes, amides, acides carboxyliques et eau.

• Les gradients linéaires sont les gradients d’élution les plus courants, et la phase mobile peut provenir du mélange de deux à quatre solvants dont les proportions varient pendant la séparation.

• Lorsqu’une séparation simple exige un temps d’analyse trop long, un gradient d’élution peut faire varier la composition de la phase mobile pendant l’analyse afin d’améliorer la séparation et de réduire le temps d’élution des composés tardifs.

💡 Astuce mémo

Isocratique : composition fixe ; gradient : composition variable

📖 7. Détection par absorption et fluorescence

★ À maîtriser

📐 Formule - La loi de Beer-Lambert relie l’absorbance à la concentration et à la longueur de trajet optique : $A=\varepsilon(\lambda)\,l\,C=\log\left(\frac{I_0}{I}\right)$.

📌 La détection UV-visible exige que les substances soient chromophores, mais permet de choisir des longueurs d’onde sélectives et d’obtenir des renseignements spectraux avec un réseau de diodes.

• La détection fluorimétrique mesure à angle droit l’émission de fluorescence d’un soluté excité par une radiation ultraviolette.

Compléments

• La détection UV-visible mesure l’absorbance absolue de l’éluant avec soluté ou la différence d’absorbance entre l’éluant et l’éluant avec soluté.

• La détection UV-visible peut utiliser une longueur d’onde fixe de 254 ou 280 nm, ou une longueur d’onde variable de 190 à 800 nm.

📌 Le détecteur fluorimétrique est environ 1000 fois plus sensible que le détecteur UV, mais nécessite des composés fluorescents ou des dérivés fluorescents et est sensible à l’oxygène dissous.

📖 8. Détection réfractométrique et conductimétrique

★ À maîtriser

• Le détecteur réfractométrique mesure en continu la différence d’indice de réfraction entre l’éluant seul et l’éluant contenant le soluté.

• Le détecteur conductimétrique mesure la conductivité électrique due à la présence d’un soluté dans la phase mobile et convient aux solutés ioniques.

Compléments

📌 Le réfractomètre à déviation mesure la déviation d’un faisceau dans deux compartiments liquides, tandis que le réfractomètre à réflexion mesure la lumière réfléchie ou transmise à une interface verre-liquide.

📌 Le détecteur réfractométrique est limité lorsque l’indice de réfraction de l’analyte est égal à celui de l’éluant et ne permet un gradient que si les solvants ont des indices semblables.

• La quantité minimale détectable par réfractométrie est comprise entre 100 ng et 1 mg, et le détecteur est très sensible à la température, qui doit être contrôlée à 0,001.

📐 Formule - La loi d’Ohm relie la tension, la résistance, le courant et la conductance : $U=RI=\frac{I}{G}$.

📐 Formule - La conductance est reliée à la conductivité, à la surface des électrodes et à leur distance par $G=\frac{\sigma S}{l}$, et la conductivité ionique vérifie $\sigma=\sum_i\lambda_i[x_i]$.

📖 9. Spectrométrie de masse et chromatogrammes

📝 Points essentiels

📌 L’introduction directe de l’éluant en spectrométrie de masse ne peut pas supporter un débit de 1 mL/min, car le débit gazeux correspondant dépasse les capacités de la pompe à vide.

• Un système split/splitless est exigé pour alimenter la spectrométrie de masse à des débits élevés.

• Le cours présente une source d’ions par électrospray comme un procédé d’ionisation d’une phase liquide par électronébulisation.

📖 10. Quantification des acides du raisin

★ À maîtriser

• L’acide fumarique est absent du jus de raisin et est ajouté à l’échantillon à 0,4 g pour 100 mL comme étalon interne.

Compléments

• L’étalonnage externe de l’analyse du jus de raisin utilise un mélange étalon d’acides organiques à 0,4 g pour 100 mL et des volumes analysés de 5 mL.

• Les aires des pics de l’étalon sont :

  • 1000 pour l’acide tartrique
  • 1200 pour l’acide ascorbique
  • 1050 pour l’acide malique
  • 1125 pour l’acide succinique
  • 975 pour l’acide fumarique

• L’échantillon de jus de raisin est filtré sur une membrane de 0,2 µm avant l’analyse.

• La colonne utilisée pour l’analyse des acides du raisin mesure 10 cm de longueur et 1 mm de diamètre interne et contient des sphères de polystyrène réticulé au divinylbenzène.

• La phase mobile de l’analyse des acides du raisin est une solution aqueuse d’acide phosphorique à 0,06 N, débitée à 25 mL/min.

📊 Tableaux de synthèse

Modes normal et inversé

Détecteurs HPLC