Fiche de révision : Cinétique et activité enzymatiques

📋 Plan du Cours

1. Rôle des enzymes dans le métabolisme
2. Nature et propriétés des enzymes
3. Substrat, site actif et coenzymes
4. Nomenclature et classes enzymatiques
5. Cinétique enzymatique de Michaelis-Menten
6. Paramètres cinétiques et affinité enzymatique
7. Activité et unités enzymatiques
8. Effecteurs de l’activité enzymatique
9. Inhibitions enzymatiques
10. Régulation allostérique
11. Isoenzymes et intérêt diagnostique
12. Site actif enzymatique
13. Régulation de l’activité enzymatique
14. Utilisation des enzymes en biologie
15. Propriétés générales des enzymes

📖 1. Rôle des enzymes dans le métabolisme

★ À maîtriser

• Le métabolisme biochimique coordonne des réactions chimiques pour assurer un apport énergétique optimal, la construction et le renouvellement des tissus.

📌 Le catabolisme détruit des molécules carbonées pour apporter de l’énergie, tandis que l’anabolisme correspond à la biosynthèse nécessaire à la construction et au renouvellement des tissus.

• Les enzymes catalysent les réactions chimiques en favorisant leur initiation et leur accélération, avec une spécificité d’action.

Compléments

• L’OMP décarboxylase accélère d’un facteur de $10^{17}$ une réaction impliquant un substrat extrêmement stable, intervenant dans la synthèse de l’ADN.

📐 Formule - L’anhydrase carbonique catalyse réversiblement la réaction $\mathrm{CO_2 + H_2O \rightarrow HCO_3^- + H^+}$ dans les globules rouges.

• Le passage des globules rouges dans les poumons dure environ 0,7 seconde et peut être inférieur à 0,5 seconde à l’effort ; l’anhydrase carbonique accélère la réaction d’un facteur de 7 000 000.

💡 Astuce mémo

Réactions lentes → catalyse enzymatique → métabolisme coordonné

📖 2. Nature et propriétés des enzymes

🔑 Notions clés & Définitions

• Enzyme : Macromolécule généralement protéique, sauf les ribozymes qui sont des ARN, produite par les cellules et dotée d’une activité catalytique.

★ À maîtriser

• Une enzyme catalyse un type donné de réaction chimique et peut agir sur un ou plusieurs substrats, parfois avec une spécificité pour un énantiomère donné.

📌 Les enzymes modifient les conditions cinétiques d’une réaction, mais pas ses conditions thermodynamiques ni ses états d’équilibre initial et final.

• Le substrat se fixe sur le site actif de l’enzyme pour former un complexe enzyme-substrat.

Compléments

• Les enzymes sont synthétisées de manière endogène par les cellules à partir d’un ou plusieurs gènes codants.

• La lactate déshydrogénase transforme le L-lactate en pyruvate, mais pas le D-lactate.

• Les enzymes agissent à très faible dose et sont régénérées identiques à elles-mêmes à la fin de la réaction.

• L’activité enzymatique est modulable par :

  • le pH
  • la température
  • la force ionique
  • la concentration du substrat
  • le type de substrat
  • des composés activateurs
  • des composés inhibiteurs

📖 3. Substrat, site actif et coenzymes

🔑 Notions clés & Définitions

• Site actif : Zone de l’enzyme où se lient le substrat et où se déroule la réaction catalytique.

📝 Points essentiels

• La fixation du substrat sur le site actif forme un complexe enzyme-substrat, puis libère des produits réactionnels différents des produits de départ.

• De nombreuses réactions enzymatiques sont réversibles : le produit peut devenir substrat et le substrat peut devenir produit.

• Le repliement tridimensionnel de la protéine rapproche certains acides aminés impliqués dans la réaction et forme des poches où se logent les substrats.

📌 L’ajustement strict du substrat au site actif est rigide, tandis qu’un ajustement plus large est lâche et reflète une plus grande flexibilité.

• Une enzyme peut être monomérique, auquel cas sa structure tertiaire détermine sa forme tridimensionnelle, ou multimérique, auquel cas sa structure quaternaire la détermine.

• L’holoenzyme est constituée d’une apoenzyme, sa partie protéique, et d’un coenzyme.

📌 Un cosubstrat n’est pas régénéré à la fin de la réaction, tandis qu’un cofacteur l’est.

📌 Un coenzyme vrai est un cosubstrat libre lié transitoirement à l’enzyme, tandis qu’un groupement prosthétique lui est lié de façon covalente.

• Les coenzymes peuvent être organiques, de structure simple et thermostables, agir à faible concentration et être libres ou associés à une enzyme; ils sont régénérés en fin de réaction enzymatique ou par des réactions secondaires.

• Des ions métalliques tels que Fe2+ et Ca2+ peuvent être fixés dans la protéine et activer le site actif.

📖 4. Nomenclature et classes enzymatiques

★ À maîtriser

• L’enzyme rapproche les molécules réactives et les oriente favorablement, ce qui diminue l’énergie d’activation nécessaire à leur rencontre sans modifier le bilan thermodynamique global.

📌 Une enzyme catalyse un seul type de réaction, mais peut agir sur un substrat ou sur une classe de substrats partageant des éléments d’architecture moléculaire adaptés à son site actif.

• Dans la nomenclature Enzyme Commission, le code E.C. comporte quatre chiffres : le premier indique la classe de réaction, le deuxième la sous-classe et le mécanisme, le troisième la nature des molécules impliquées et le quatrième le numéro d’ordre historique de l’identification dans la sous-classe.

• Les six classes enzymatiques sont :

  • les oxydoréductases EC1
  • les transférases EC2
  • les hydrolases EC3
  • les lyases EC4
  • les isomérases EC5
  • les ligases ou synthases EC6

Compléments

• La β-galactosidase rompt la liaison O-glycosidique du β-D-galactoside, mais pas celle du β-L-galactoside.

📌 L’hexokinase agit sur plusieurs sucres, tandis que la glucokinase est beaucoup plus spécifique; toutes deux catalysent une réaction de phosphorylation.

• La nomenclature historique des enzymes peut être incohérente et forme souvent le nom à partir du substrat, de la réaction et du suffixe « -ase ».

• Les oxydoréductases EC1 catalysent des transferts d’oxydoréduction, tandis que les transférases EC2 transfèrent un résidu d’une molécule à une autre.

• Les hydrolases EC3 coupent une liaison covalente avec une molécule d’eau comme réactif et produisent deux composés, dont l’un porte une fonction OH terminale.

• Les lyases EC4 coupent des liaisons covalentes avec perte ou élimination d’une fonction et peuvent nécessiter un cofacteur.

• Les isomérases EC5 catalysent des transpositions intramoléculaires et comprennent notamment les racémases et les épimérases.

• Les ligases ou synthétases EC6 créent des liaisons covalentes grâce à l’énergie de l’hydrolyse d’un nucléoside triphosphate tel que l’ATP, hydrolysé en ADP et Pi ou en AMP et pyrophosphate.

📖 5. Cinétique enzymatique de Michaelis-Menten

🔑 Notions clés & Définitions

• Vitesse initiale : Vitesse au début de la réaction, donnée par la tangente à la courbe de formation du produit pendant la première phase linéaire.

• Constante de Michaelis : Concentration en substrat pour laquelle l’enzyme fonctionne à la moitié de sa vitesse maximale.

★ À maîtriser

• Dans le modèle mono-substrat, la réaction suit le schéma $E + S \rightleftharpoons ES \rightarrow E + P$, où le complexe enzyme-substrat est un intermédiaire obligatoire.

📌 À faible concentration en substrat, la vitesse est proportionnelle à [S] et la réaction est d’ordre 1; à forte concentration, l’enzyme est saturée, la vitesse tend vers une valeur maximale et la réaction est d’ordre 0.

Compléments

• Le modèle de cinétique enzymatique à un seul substrat a été décrit par Michaelis et Menten en 1913.

• À l’état stationnaire, la vitesse de formation du produit augmente linéairement avec la concentration en enzyme.

• Au début de la réaction, la concentration en substrat diminue rapidement tandis que le complexe ES augmente rapidement et le produit augmente plus lentement; pendant la phase linéaire, ES reste stable, le produit augmente linéairement et le substrat diminue linéairement; enfin, l’épuisement du substrat fait chuter ES et stabilise le produit.

• Dans le modèle de Michaelis-Menten, l’enzyme totale vérifie $[E_T]=[E]+[ES]$.

📐 Formule - La constante de Michaelis vérifie $K_M=\frac{k_{-1}+k_2}{k_1}$ et, dans l’état stationnaire décrit, $[ES]=\frac{[E][S]}{K_M}$.

📐 Formule - La vitesse de formation du produit vérifie $v=k_2[ES]$ et la vitesse maximale vérifie $V_M=k_2[E_T]$.

📖 6. Paramètres cinétiques et affinité enzymatique

★ À maîtriser

• Quand la concentration en substrat [S] est égale à KM, la vitesse v vaut la moitié de la vitesse maximale VM.

📌 KM est approximativement égale à KD, constante de dissociation de E + S ⇄ ES, et mesure inversement l’affinité de l’enzyme pour son substrat : plus KM est élevée, plus l’affinité est faible.

• La vitesse maximale VM correspond à l’asymptote de la courbe et est approchée lorsque [S] est supérieure à dix fois KM.

Compléments

• KM est exprimée dans des conditions expérimentales données, est indépendante de [E] et de [S], et possède la dimension d’une concentration en mol·l⁻¹.

• Une valeur de KM inférieure à 10⁻⁶ M indique une forte affinité de l’enzyme pour son substrat.

• Une valeur de KM comprise entre 10⁻² M et 10⁻¹ M indique une faible affinité de l’enzyme pour son substrat.

• Lorsque [S] est inférieure à 10⁻² KM, la vitesse est inférieure à 0,01 VM et la capacité d’accélération est élevée.

• Lorsque [S] est comprise entre 10⁻¹ KM et 10 KM, la vitesse est comprise entre 0,1 VM et 0,9 VM et la capacité d’accélération est faible.

💡 Astuce mémo

KM élevé : affinité faible ; KM faible : affinité forte

📖 7. Activité et unités enzymatiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Katal : La quantité d’enzyme qui catalyse une mole de substrat par seconde.
• Unité internationale : La quantité d’enzyme nécessaire pour catalyser une micromole de substrat par minute.
• Activité spécifique : L’activité enzymatique par milligramme de protéine purifiée, exprimée en μkat/mg ou en UI/mg.

★ À maîtriser

• Dans la représentation linéaire de Lineweaver-Burk, l’ordonnée à l’origine vaut 1/VM et l’abscisse à l’origine vaut −1/KM.

📐 Formule - La représentation linéaire s’écrit $\frac{1}{V}=\frac{K_M}{V_M[S]}+\frac{1}{V_M}$.

Compléments

• Les méthodes expérimentales de détermination des paramètres cinétiques sont approximatives et manquent de précision.

• Soixante UI valent 1 μkat, et 1 kat vaut 60 × 10⁶ UI.

📖 8. Effecteurs de l’activité enzymatique

🔑 Notions clés & Définitions

• Métalloenzyme : Une enzyme dont un ou plusieurs ions métalliques associés à la structure protéique sont essentiels à l’activité catalytique ou au maintien de la structure tridimensionnelle.

★ À maîtriser

• L’élévation de la température accroît l’agitation du milieu et l’efficacité enzymatique, mais fragilise la structure tridimensionnelle de l’enzyme et peut provoquer sa dénaturation.

• La courbe d’activité en fonction du pH présente généralement un optimum proche de 7, tandis que la pepsine gastrique agit à un pH inférieur à 4.

Compléments

• La température optimale indiquée pour l’organisme humain est de 37 °C, tandis que les températures optimales varient selon les conditions environnementales.

• Le pH agit sur : l’ionisation du substrat, l’ionisation de l’enzyme, la dénaturation de la protéine en milieu très acide ou très alcalin

• Les cofacteurs métalliques sont généralement des cations divalents tels que :

  • Mg²⁺
  • Ca²⁺
  • Fe²⁺
  • Cu²⁺
  • Zn²⁺

• Les ions métalliques peuvent participer à : la fixation du substrat, l’activation du substrat, le maintien de la structure tridimensionnelle de l’enzyme

• Certaines enzymes utilisées en génie génétique sont très résistantes à la température parce qu’elles proviennent de bactéries.

• L’anhydrase carbonique est associée au Zn²⁺, et l’exemple ADN est associé au Mg²⁺.

💡 Astuce mémo

Température excessive → dénaturation → activité réduite

📖 9. Inhibitions enzymatiques

★ À maîtriser

• Les inhibiteurs enzymatiques peuvent interagir avec :
  • l’enzyme
  • le substrat
  • le complexe enzyme-substrat

📌 L’inhibition compétitive résulte de la fixation de l’inhibiteur sur le site actif en concurrence avec le substrat ; VM reste inchangée et KM augmente.

📌 L’inhibition non compétitive résulte de la fixation de l’inhibiteur ailleurs que sur le site actif ; le substrat peut se fixer normalement, mais VM diminue et KM reste inchangée.

Compléments

📌 Un inhibiteur réversible peut se dissocier rapidement du complexe, tandis qu’un inhibiteur non réversible rend l’enzyme inutilisable par destruction.

• Peuvent être des inhibiteurs enzymatiques :

  • les molécules environnementales
  • les drogues
  • les médicaments

• Les statines inhibent la HMG-CoA réductase impliquée dans la synthèse du cholestérol.

📌 L’inhibition incompétitive agit uniquement sur le complexe ES et diminue KM tout en diminuant VM.

• L’inhibition par excès de substrat concerne les enzymes possédant un double site de fixation et rend le complexe inactif par encombrement stérique du site actif.

💡 Astuce mémo

Compétitive : KM augmente, VM stable ; non compétitive : VM diminue, KM stable

📖 10. Régulation allostérique

★ À maîtriser

• Le modèle allostérique concerté se caractérise par : une cinétique non michaelienne, une courbe sigmoïde de la vitesse en fonction du substrat, une enzyme oligomérique

📌 La conformation T tendue, prédominante lorsque le substrat est peu abondant, possède une faible affinité et une faible activité, tandis que la conformation R relâchée possède une forte affinité et une forte activité.

Compléments

• La fixation du substrat fait progressivement basculer l’enzyme de la conformation T vers la conformation R, et une concentration seuil en substrat est nécessaire pour déclencher une forte activité enzymatique.

• Un inhibiteur allostérique décale la réponse vers la droite et favorise la forme T, tandis qu’un activateur allostérique la décale vers la gauche et favorise la forme R.

📖 11. Isoenzymes et intérêt diagnostique

🔑 Notions clés & Définitions

• Isoenzymes : Des protéines ou enzymes de structures différentes qui catalysent la même réaction biochimique.

★ À maîtriser

• La lactate déshydrogénase (LDH) est un tétramère composé de sous-unités M ou H, dont les cinq associations possibles forment cinq isoenzymes.

📌 Les formes H4 et MH3, présentes dans le cœur et les reins, sont sensibles à un excès de pyruvate, tandis que M4 et M3H, présentes dans les muscles et le foie, y sont peu sensibles.

Compléments

• Les isoenzymes peuvent être codées par des gènes différents et présenter des compositions en sous-unités, des affinités pour le substrat, des propriétés immunologiques, des migrations électrophorétiques et des sensibilités aux inhibiteurs différentes.

• La malate déshydrogénase existe sous des formes cytoplasmique et mitochondriale codées respectivement par MDH1 et MDH2.

• La LDH catalyse la transformation de l’acide lactique en acide pyruvique, avec le NAD comme accepteur de protons et d’électrons.

• Les isoenzymes de LDH ont des propriétés électrophorétiques différentes principalement en raison des différences de charge électrique de leurs sous-unités, qui modifient leur capacité de migration.

• Les formes H4 et MH3 favorisent la dégradation du pyruvate dans le cycle de Krebs, tandis que les formes M4 et M3H favorisent la glycolyse et la transformation d’une partie du pyruvate en lactate.

• Le profil d’isoenzymes peut aider à déterminer le type tissulaire d’une atteinte et à rechercher des altérations ou nécroses hépatiques ou des atteintes cardiaques.

📖 12. Site actif enzymatique

🔑 Notions clés & Définitions

• Site actif : Une entité tridimensionnelle, généralement en forme de fissure ou de crevasse, qui occupe une faible part du volume enzymatique et où se déroule la réaction enzymatique.

★ À maîtriser

• L’interaction entre le site actif et le substrat met en jeu des interactions faibles non covalentes.

📌 Le site actif comprend un site de liaison qui reconnaît et maintient le substrat par des interactions faibles et garantit la spécificité, ainsi qu’un site catalytique où interviennent les acides aminés réactifs.

• Selon le modèle de Koshland, l’ajustement induit correspond à la modification de la structure de l’enzyme lors de la liaison au substrat, ce qui permet une forme complémentaire et une conformation active en utilisant une partie de l’énergie d’interaction; son degré détermine une spécificité stricte ou lâche.

• La liaison enzyme-substrat repose sur des interactions non covalentes ioniques, hydrogène et de transfert de charge; une liaison covalente peut toutefois se former transitoirement au cours de la catalyse proprement dite.

Compléments

• Le site actif comporte des groupes de contact qui agissent directement avec le substrat pour la réaction.

• Le site actif est une entité tridimensionnelle généralement formée d’un sillon ou d’une crevasse, de volume réduit, où se déroule la réaction enzymatique.

• Les groupes du site actif se répartissent en : groupes de contact, qui agissent directement avec le substrat, groupes auxiliaires, qui déterminent la conformation de la zone réactionnelle, groupes indifférents, qui ne participent pas à la construction du site actif

• Les acides aminés réactifs du site catalytique sont :

  • sérine
  • tyrosine
  • aspartate
  • glutamate
  • lysine
  • histidine
  • cystéine

📖 13. Régulation de l’activité enzymatique

🔑 Notions clés & Définitions

• Étape limitante : La réaction la plus lente d’une voie métabolique, qui régule l’activité de la voie.

★ À maîtriser

📌 Les modifications covalentes post-traductionnelles réversibles activent ou inhibent rapidement une enzyme, tandis que la protéolyse d’un zymogène inactive est irréversible.

Compléments

• La synthèse enzymatique est contrôlée génétiquement par induction ou répression de l’expression des gènes selon les besoins de l’organisme.

• La phosphorylation par une kinase et la déphosphorylation par une phosphatase sont les modifications covalentes réversibles les plus importantes de la régulation enzymatique.

• Un zymogène est activé par protéolyse partielle de son précurseur inactif; cette hydrolyse irréversible ne peut agir qu’une fois et peut déclencher une cascade d’activation, comme dans la coagulation.

• L’activité au site catalytique peut être régulée par le produit final, le précurseur, les concentrations de substrat et de coenzyme, ainsi que par la vitesse de l’enzyme la plus lente d’une cascade.

• La lipase des triglycérides est active sous forme phosphorylée.

💡 Astuce mémo

Réversible par modification covalente, irréversible par protéolyse du zymogène

📖 14. Utilisation des enzymes en biologie

🔑 Notions clés & Définitions

• Enzymopathie : Une déficience enzymatique ou en cofacteur qui entraîne l’accumulation de substrats parfois toxiques ou pathologiques, ou la production de composés non physiologiques.

★ À maîtriser

• La phénylcétonurie résulte d’un déficit en phénylalanine hydroxylase, qui empêche la transformation de la phénylalanine en tyrosine et entraîne une accumulation de phénylalanine toxique notamment pour le cerveau.

• Le dosage enzymatique en cinétique mesure au cours du temps l’absorbance d’un produit à une longueur d’onde donnée ; la variation d’absorbance par minute, divisée par le produit du coefficient d’absorption molaire et du trajet optique, permet d’obtenir la vitesse de formation du produit, dont on déduit l’activité enzymatique en tenant compte des volumes utilisés.

• Dans un dosage enzymatique en point final d’un métabolite, le sérum est ajouté à une solution d’enzyme et de cosubstrat, la réaction produit un cosubstrat réduit absorbant, puis la différence d’absorbance initiale et finale est convertie en concentration de métabolite à l’aide du coefficient d’absorbance.

Compléments

• L’alcaptonurie résulte d’un déficit en homogentysate dioxygénase, qui empêche la transformation de l’acide homogentisique en maleylacétoacétate; elle provoque notamment le noircissement des urines à la lumière, une ochronose et des atteintes articulaires, cardiaques et rénales.

• En 1908, Sir Archibald Garrod décrit l’alcaptonurie comme une « inborn error of metabolism ».

• La phénylcétonurie, maladie innée du métabolisme transmise sur un mode autosomique récessif, touche environ 1 personne sur 10 000 en Europe et est dépistée chez le nouveau-né par mesure de la phénylalanine sanguine.

• Le traitement de la phénylcétonurie repose sur un régime pauvre en phénylalanine; sans prise en charge, la maladie peut entraîner un retard de croissance et une déficience intellectuelle.

• Les statines inhibent l’HMG-CoA réductase et illustrent l’utilisation pharmacologique d’inhibiteurs enzymatiques.

• Pour doser le glucose, la glucose-6-phosphate déshydrogénase catalyse la réaction $\mathrm{Glc\ 6P + NAD^+ \rightarrow 6\text{-}phosphogluconate + NADH}$, et la quantité de NADH formée est proportionnelle à la quantité initiale de glucose dans le sérum.

• Le NAD+ oxydé absorbe à 260 nm, tandis que le NADH réduit absorbe à 260 nm et à 340 nm.

• Les enzymes mesurées pour le diagnostic ou la surveillance comprennent la lipase d’origine pancréatique, la créatine phosphokinase des muscles, la lactate déshydrogénase en cas de cytolyse, les phosphatases alcalines d’origine osseuse, hépatique ou placentaire, et la gamma-glutamyl-transpeptidase hépatique.

📖 15. Propriétés générales des enzymes

★ À maîtriser

• Les enzymes sont majoritairement des protéines, à l’exception de certains ARN, et agissent comme des catalyseurs spécifiques du substrat et du type de réaction chimique.

Compléments

• Les enzymes sont thermosensibles, leur activité dépend du pH et leur activité est régulée; elles sont indispensables à la vie d’un organisme.