Fiche de révision : Édition du génome chez les plantes

📋 Plan du Cours

1. Fondements de la transgenèse végétale
2. Étapes de la transgenèse classique
3. Techniques de transformation végétale
4. Effets génomiques et risques réglementaires
5. Réparation des cassures double-brin
6. Ciblage génique et recombinaison
7. Physcomitrella comme modèle
8. Induction ciblée des cassures
9. Applications de l’édition génomique
10. NGT et amélioration variétale
11. Réglementation européenne des NGT
12. Limites et perspectives

📖 1. Fondements de la transgenèse végétale

🔑 Notions clés & Définitions

• Universalité du code génétique : Permet d’utiliser la séquence d’un gène quelle que soit son origine, végétale, bactérienne ou animale.
• Vecteur de transfert : Un vecteur de transfert fait pénétrer un fragment d’ADN dans la cellule et le génome végétal, par une méthode biologique, physique ou chimique.
• Totipotence cellulaire : Permet de régénérer une plante entière à partir d’une cellule.

💡 Astuce mémo

UVT : Universalité, Vecteurs, Totipotence

📖 2. Étapes de la transgenèse classique

📝 Points essentiels

• La transgenèse classique comprend l’identification du gène d’intérêt, son isolement, son intégration dans une construction génétique, la multiplication de cette construction, le transfert et la sélection des cellules transformées, la régénération, l’évaluation de l’expression du gène, puis son incorporation par croisements dans une variété commerciale.

💡 Astuce mémo

Identifier → isoler → construire → transférer → régénérer → évaluer → croiser

📖 3. Techniques de transformation végétale

★ À maîtriser

• La coculture d’explants végétaux avec une suspension d’Agrobacterium transformé permet de transformer les cellules végétales, qui sont ensuite sélectionnées sur un milieu où seules les cellules transformées se développent.

• La biolistique bombarde les tissus végétaux avec des microparticules enrobées d’ADN.

Compléments

• Le PEG facilite le transfert de l’ADN à travers les membranes des protoplastes, tandis que l’électroporation les perméabilise par des chocs électriques.

💡 Astuce mémo

Agrobacterium transfère biologiquement, la biolistique transfère physiquement

📖 4. Effets génomiques et risques réglementaires

★ À maîtriser

• La transgenèse classique produit une insertion aléatoire par recombinaison illégitime, avec des insertions multiples et des remaniements fréquents du transgène et du site d’insertion.

📌 L’étude des effets génomiques de la transgenèse fait partie de l’évaluation des risques prévue par la réglementation européenne.

Compléments

• Les insertions aléatoires peuvent provoquer des délétions, des insertions d’ADN, des translocations et des duplications.

• La directive 2001/18 encadre l’utilisation des OGM en milieu confiné et leur dissémination volontaire dans l’environnement.

💡 Astuce mémo

Insertion aléatoire → remaniements génomiques → évaluation des risques

📖 5. Réparation des cassures double-brin

🔑 Notions clés & Définitions

• DNA Damage Check Point : Détecte les cassures double-brin de l’ADN et ralentit ou arrête le cycle cellulaire le temps de leur réparation.
• Recombinaison homologue : Mécanisme moléculaire d’échange d’information génétique entre deux séquences présentant une homologie de séquence.
• SSA : La SSA est un sous-mécanisme de recombinaison homologue qui utilise des régions répétées homologues séparées par une cassure, nécessite au minimum 30 paires de bases d’homologie et provoque de grandes délétions sans insertion de nucléotides.
• MMEJ : La MMEJ ligature des extrémités indépendamment de Ku70/Ku80 grâce à une micro-homologie de 5 à 25 paires de bases et produit toujours des délétions, avec des insertions de nucléotides assez fréquentes.
• NHEJ : La NHEJ ligature des extrémités d’ADN sans homologie et peut produire des insertions ou des délétions de quelques paires de bases.

★ À maîtriser

• Les cassures double-brin peuvent être provoquées par:
  • des dérivés réactifs de l’oxygène
  • des erreurs de réplication
  • les UV
  • des produits chimiques
  • la radioactivité

Compléments

• Une cellule subit environ 10 cassures double-brin de l’ADN par jour, et la radioactivité provoque 20 à 40 cassures par cellule et par Gray.

💡 Astuce mémo

Homologie pour HR, absence d’homologie pour NHEJ

📖 6. Ciblage génique et recombinaison

🔑 Notions clés & Définitions

• Ciblage génique : Insertion d’un fragment d’ADN exogène dans un locus donné par recombinaison homologue.

📝 Points essentiels

• Les outils de ciblage génique comprennent:
  • le knock-out du gène
  • le remplacement d’allèle
  • le landing-pad

📐 Formule — L’efficacité de ciblage vérifie $E = \frac{\text{intégrations ciblées}}{\text{intégrations stables}}$.

• Chez les plantes supérieures, la fréquence du ciblage génique est de 0,01 à 0,1 %, et une homologie de 700 paires de bases peut atteindre 80 % dans les conditions présentées.

💡 Astuce mémo

Insertion aléatoire ≠ insertion ciblée

📖 7. Physcomitrella comme modèle

★ À maîtriser

• Physcomitrella patens possède une dominance du stade haploïde, un cycle de développement rapide de 10 à 12 semaines et des capacités régénératives à partir de protoplastes ou d’explants.

• Chez Physcomitrella patens, le double mutant rad51-1/2 est incompétent pour le ciblage génique, alors que les mutants simples ne sont pas affectés dans l’intégration aléatoire de l’ADN ni dans le ciblage génique.

Compléments

• Physcomitrella patens possède un nombre chromosomique n=27 et un génome d’environ 500 Mb.

💡 Astuce mémo

Une mousse haploïde régénérable, facile à sélectionner

📖 8. Induction ciblée des cassures

🔑 Notions clés & Définitions

• Méganucléases : Endonucléases qui coupent l’ADN double-brin sur un site de reconnaissance de 12 à 40 paires de bases.
• Zinc finger nucleases : Les ZFN sont des nucléases artificielles associant un domaine de liaison à l’ADN constitué de doigts de zinc et le domaine catalytique de l’endonucléase FokI.
• TALEN : Les TALEN sont des TALE fusionnés au domaine catalytique de FokI, dont les répétitions de 33 à 35 acides aminés reconnaissent l’ADN selon leurs diresidus variables RVD.
• CRISPR/Cas9 : CRISPR/Cas9 est une nucléase guidée par les 20 premiers nucléotides d’un ARN guide, dont la cible doit être proche d’un motif PAM NGG.

📝 Points essentiels

• Les cassures double-brin augmentent de 10 à 100 fois la recombinaison homologue et la fréquence du ciblage génique chez les plantes.

• Les Site Directed Nucleases comprennent:

  • les méganucléases
  • les zinc finger nucleases
  • les TALEN
  • CRISPR/Cas9

• Chaque doigt de zinc reconnaît spécifiquement 3 paires de bases, et FokI doit fonctionner en dimère avec deux ZFN encadrant le site cible.

💡 Astuce mémo

Méganucléase → ZFN → TALEN → CRISPR/Cas9

📖 9. Applications de l’édition génomique

🔑 Notions clés & Définitions

• CRISPRi : Utilise dCas9 et un ARN guide pour interférer avec l’élongation transcriptionnelle, la liaison de l’ARN polymérase ou l’accrochage des facteurs de transcription, sans couper l’ADN.
• Base editing : Le base editing utilise des éditeurs de cytosine ou d’adénine pour modifier des bases de l’ADN ou de l’ARN avec une réduction du ciblage hors-cible.
• Prime editing : Le prime editing associe une Cas9 nickase à une transcriptase inverse modifiée et à un pegRNA qui spécifie la cible et sert de matrice.

📝 Points essentiels

• Les SDN permettent la mutagenèse ciblée, l’insertion ciblée et le ciblage génique par induction de cassures double-brin au locus choisi.

• Les nickases produisent des cassures simple-brin et peuvent réduire les effets hors-cible, car les cassures simple-brin sont religuées sans mutation et leur utilisation en paire augmente la longueur d’hybridation à la cible.

💡 Astuce mémo

Casser pour modifier, nickaser pour sécuriser, dCas9 pour réguler

📖 10. NGT et amélioration variétale

★ À maîtriser

• Le SDN-1 laisse la cellule réparer la cassure double-brin par recombinaison illégitime sans ADN donneur, ce qui crée des mutations ponctuelles ou des délétions et permet un knock-out.

• Le SDN-2 fournit une cassette presque identique au locus cible mais comportant quelques bases modifiées, dont l’intégration par recombinaison homologue permet un remplacement d’allèle.

• Le SDN-3 insère un transgène au niveau de la cassure, soit par recombinaison homologue avec des régions homologues, soit par recombinaison illégitime dirigée sans région homologue.

Compléments

• Les cassures multiples peuvent produire:
  • des knock-outs simultanés
  • des délétions chromosomiques étendues
  • des inversions de gènes en cluster
  • des gènes chimériques

💡 Astuce mémo

SDN-1 : mutation, SDN-2 : modification, SDN-3 : insertion

📖 11. Réglementation européenne des NGT

★ À maîtriser

• Les groupes de NGT sont: les NGT produisant des cassures double-brin, les NGT produisant des cassures simple-brin ou aucune cassure, les NGT induisant des modifications épigénétiques, les NGT agissant sur les ARN transcrits

• Une plante NGT-1 est considérée comme équivalente à une plante conventionnelle lorsqu’elle diffère de la plante initiale par au maximum 20 modifications génétiques par génome monoploïde.

📌 Pour la mutagenèse ciblée d’une plante NGT-1, les modifications peuvent être une substitution ou une insertion de 20 nucléotides au maximum, une délétion d’un nombre quelconque de nucléotides, avec au plus trois modifications par séquence codante.

📌 La cisgenèse NGT-1 exige que la séquence modifiée existe dans le pool génique de l’espèce et qu’elle n’interrompe pas un gène endogène.

Compléments

• En 2019, le Conseil de l’Union européenne a demandé à la Commission d’étudier le statut des nouvelles techniques génomiques au regard du droit de l’Union.

💡 Astuce mémo

NGT-1 équivalente au conventionnel, NGT-2 soumise à un traitement distinct

📖 12. Limites et perspectives

★ À maîtriser

• Les limites concernent: l’identification des gènes et allèles d’intérêt, la transformation des lignées élites et des espèces mineures, l’efficacité du knock-in, la réglementation européenne, la propriété intellectuelle, l’acceptation publique, les marchés internationaux

• Les applications agronomiques comprennent: la résistance aux maladies, la tolérance aux herbicides, la réduction des composés antinutritionnels et des allergènes, l’amélioration de la valeur nutritionnelle, la prolongation de la durée de conservation, l’amélioration du rendement, l’amélioration de la conversion de la biomasse en biocarburants

Compléments

• Les SDN peuvent faciliter l’insertion d’assortiments d’allèles dans des génotypes donnés sans croisement, le pyramidage de QTL dans les lignées élites et l’introduction d’allèles d’intérêt chez les espèces mineures ou orphelines.

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des voies de réparation

Applications des SDN