Fiche de révision : Électrophorèse capillaire et sur gel

📋 Plan du Cours

1. Principes de l’électrophorèse
2. Migration dans les gels
3. Migration en électrophorèse capillaire
4. Identification et détection capillaires
5. Séparation micellaire des molécules neutres
6. Injection et paramètres du capillaire
7. Comparaison des supports électrophorétiques

📖 1. Principes de l’électrophorèse

🔑 Notions clés & Définitions

• Électrophorèse : Séparation des espèces chargées en solution par leur migration sous l’influence d’un champ électrique.

★ À maîtriser

📌 En électrophorèse de zone, les espèces sont déposées sur un support, tandis qu’en électrophorèse capillaire elles sont introduites dans un capillaire.

Compléments

• Dans le dispositif électrophorétique, le support ou le capillaire relie deux réservoirs d’électrolyte tampon équipés chacun d’une électrode, entre lesquelles une différence de potentiel peut atteindre 30 kV.

• Les espèces migrent à des vitesses différentes selon leur charge et leur taille, puis peuvent être détectées par un système UV.

💡 Astuce mémo

Sur support, dépôt en zone ; dans un tube, injection capillaire.

📖 2. Migration dans les gels

★ À maîtriser

• En électrophorèse sur gel, l’échantillon est déposé dans des puits préformés d’un gel de polyacrylamide (PAGE) ou d’agarose, puis les molécules chargées migrent vers le pôle de signe opposé.

• Dans l’électrophorèse sur gel, une filtration par le gel se superpose aux forces électriques et améliore la séparation.

📐 Formule - Le facteur de retardation est le rapport entre la distance parcourue par une molécule et celle parcourue par une molécule étalon : $Rf = \frac{\text{distance parcourue par la molécule}}{\text{distance parcourue par l’étalon}}$.

Compléments

• L’électrophorèse sur gel s’applique notamment aux polypeptides (protéines), aux oligonucléotides (fragments d’ADN ou d’ARN) et aux mono- et polysaccharides.

• Les molécules séparées sur gel peuvent être détectées directement dans l’UV ou le visible, ou révélées par complexation, par exemple avec la ninhydrine qui forme le violet de Ruhemann absorbant dans l’UV.

• Un densitomètre peut mesurer l’intensité des bandes d’un gel et fournir des informations quantitatives.

📖 3. Migration en électrophorèse capillaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Migration électrophorétique : Déplacement d’une molécule chargée dans un électrolyte immobile sous l’action d’un champ électrique, vers l’électrode de signe opposé.
• Flux électro-osmotique : Écoulement de l’électrolyte dans le capillaire sous l’effet du champ électrique.

★ À maîtriser

📐 Formule - Le champ électrique dans le capillaire vérifie $E = \frac{U}{L}$, où U est la différence de potentiel imposée et L la longueur totale du capillaire.

📐 Formule - La mobilité électrophorétique est reliée à la vitesse électrophorétique et au champ par $\mu_e = \frac{v_e}{E}$.

📌 À pH supérieur à 2, les groupements silanols de la paroi interne en silice sont déprotonés et forment une couche anionique fixe qui attire les cations de l’électrolyte.

📐 Formule - La mobilité apparente est la somme de la mobilité électrophorétique et de la mobilité électro-osmotique : $\mu_{app} = \mu_e + \mu_{os}$.

• Le flux électro-osmotique peut entraîner toutes les molécules vers la cathode, y compris les anions.

Compléments

• L’électrophorèse capillaire remplace la plaque de gel par un tube de silice de 30 à 100 μm de diamètre et de 30 cm à 1 m de longueur, placé dans une enceinte réfrigérée.

📐 Formule - La force électrique exercée sur une particule chargée est $F = qE$, où q est sa charge et E le champ électrique.

• Une molécule neutre n’a pas de migration électrophorétique, et une charge plus grande ou une taille plus petite augmente la vitesse électrophorétique.

📐 Formule - La mobilité électro-osmotique est reliée à la vitesse électro-osmotique et au champ par $\mu_{os} = \frac{v_{os}}{E}$.

💡 Astuce mémo

Paroi de silice déprotonée → flux électro-osmotique vers la cathode.

📖 4. Identification et détection capillaires

★ À maîtriser

📐 Formule - La mobilité apparente vérifie $\mu_{app} = \frac{v_{app}}{E}$.

📐 Formule - La mobilité électrophorétique se calcule à partir des mobilités apparente et électro-osmotique par $\mu_e = \mu_{app} - \mu_{os}$.

• L’identification en électrophorèse capillaire repose sur la mobilité électrophorétique calculée, et non sur le seul temps de migration.

Compléments

• Pour obtenir les vitesses apparente et électro-osmotique, on mesure les temps d’arrivée au détecteur d’une molécule chargée (tapp) et d’une molécule neutre (tos), puis on divise la longueur l entre l’extrémité du capillaire et le détecteur par le temps correspondant.

• Les molécules sont détectées par un détecteur UV-Vis à longueur d’onde fixe, choisie pour correspondre à leur absorption, au niveau d’une fenêtre où la gaine protectrice du capillaire est retirée.

• L’électrophorégramme présente les temps de migration des espèces arrivant au détecteur, correspondant à tos pour une molécule neutre ou à tapp pour une molécule chargée.

• L’analyse quantitative en électrophorèse capillaire peut être réalisée par étalonnage externe en utilisant l’aire des pics en fonction de la concentration.

📖 5. Séparation micellaire des molécules neutres

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie électrocinétique micellaire : Technique qui sépare des molécules neutres en exploitant leur hydrophobicité et leur partage entre la phase aqueuse et des micelles chargées.

★ À maîtriser

📌 Pour former des micelles, la concentration du tensioactif doit dépasser la concentration micellaire critique (CMC) ; dans l’eau, la CMC est d’environ 8 mM pour le SDS et 1 mM pour le CTAB.

• À pH supérieur à 5, le flux électro-osmotique vers la cathode est assez puissant pour entraîner les micelles de SDS vers la cathode malgré leur migration électrophorétique vers l’anode.

• En CEM, les analytes neutres se partagent dynamiquement entre la phase aqueuse et le cœur hydrophobe des micelles, qui constituent une pseudo-phase stationnaire mobile.

📌 En CEM, un composé plus hydrophobe séjourne davantage dans les micelles et migre plus lentement, tandis qu’un composé plus hydrophile reste davantage dans la phase aqueuse et migre plus rapidement.

Compléments

• Le SDS est un tensioactif anionique qui forme des micelles sphériques chargées négativement en surface et dotées d’un cœur hydrophobe.

• Le CTAB est un tensioactif cationique qui forme des micelles sphériques chargées positivement en surface et dotées d’un cœur hydrophobe.

• La CEM est notamment utilisée pour doser des phénols et alkylphénols, suivre des pesticides neutres tels que les triazines et les urées substituées, ainsi que suivre des parabènes.

💡 Astuce mémo

Hydrophobe : séjourne dans la micelle et ralentit ; hydrophile : reste dans l’eau et migre vite.

📖 6. Injection et paramètres du capillaire

★ À maîtriser

• L’injection hydrostatique consiste à plonger l’extrémité du capillaire dans l’échantillon contenant l’électrolyte et les molécules à doser, puis à provoquer une aspiration à l’autre extrémité, éventuellement renforcée par une pressurisation de quelques mbar du pilulier.

Compléments

📐 Formule - Le débit volumique aspiré par pression suit la relation $Q = \frac{\pi d_c^4 \Delta P_0}{128\eta L}$, où dc est le diamètre intérieur, ΔP0 la différence de pression, η la viscosité et L la longueur totale du capillaire.

• Avec les paramètres d’injection donnés, le volume aspiré est de 4,35 × 10⁻⁶ cm³ par seconde, soit 21,8 nL en 5 secondes.

📐 Formule - Le volume intérieur du capillaire est $V = \frac{\pi}{4}d_c^2L$.

• Pour un capillaire de 61,5 cm de longueur et de 75 × 10⁻⁴ cm de diamètre intérieur, le volume intérieur est de 0,0027 cm³, soit 0,0027 mL ou 2,7 μL.

📐 Formule - Le temps nécessaire pour rincer une fois le volume du capillaire est $t = \frac{32\eta L^2}{d_c^2\Delta P_0}$.

• Pour un conditionnement sous une pression de 20 psi avec les dimensions de capillaire indiquées, le rinçage d’un volume de capillaire dure 15,6 s.

📖 7. Comparaison des supports électrophorétiques

★ À maîtriser

📌 L’électrophorèse capillaire utilise un capillaire de silice et associe migration électrophorétique et flux osmotique, tandis que l’électrophorèse sur plaque utilise un gel d’agarose et repose sur la migration électrophorétique.

📌 En électrophorèse capillaire, les cations et les anions migrent vers la cathode sous l’effet du flux électro-osmotique, tandis que sur plaque les cations migrent vers la cathode et les anions vers l’anode.

Compléments

• La différence de potentiel indiquée est de 30 000 V en électrophorèse capillaire et de 30 V en électrophorèse sur plaque.

• Le temps d’analyse indiqué est de 10 min en électrophorèse capillaire et de 60 min ou plus sur plaque.

• L’électrophorèse capillaire permet une détection UV-Vis et des mesures qualitatives et quantitatives, tandis que l’électrophorèse sur plaque offre une détection visuelle directe ou par complexation et une mesure qualitative.

💡 Astuce mémo

Le capillaire combine migration et flux osmotique ; le gel repose sur la migration électrophorétique.

📊 Tableaux de synthèse

Électrophorèse capillaire et sur plaque