Fiche de révision : Techniques d’étude des protéines

📋 Plan du Cours

1. Séparation et purification des protéines
2. Principes de l’électrophorèse
3. Manipulation et analyse de l’hémoglobine
4. Interprétation des protéines de l’œuf
5. Caractérisation des protéines
6. Analyse fonctionnelle et expérimentale

📖 1. Séparation et purification des protéines

★ À maîtriser

• La centrifugation permet de séparer les protéines des autres constituants cellulaires.

• La chromatographie en phase liquide sépare les protéines d’un mélange et permet d’en purifier certaines.

Compléments

• Une protéine d’environ 50 kDa présente une affinité moyenne pour la cycline B2 et une forte affinité pour la cycline B3.

📖 2. Principes de l’électrophorèse

★ À maîtriser

📌 En électrophorèse non dénaturante, la séparation dépend de la charge, de la longueur donc de la masse moléculaire, et de la structure tridimensionnelle des protéines.

• En électrophorèse avec SDS, la séparation des protéines dépend uniquement de leur masse moléculaire.

• L’épaisseur d’une bande d’électrophorèse traduit la quantité de protéines présente dans l’échantillon.

Compléments

• En électrophorèse, la distance de migration permet d’estimer la masse des protéines lorsque les conditions de séparation le permettent.

• La séparation d’un grand nombre de protéines peut être réalisée par électrophorèse bidimensionnelle.

💡 Astuce mémo

En électrophorèse native, la charge, la masse et la structure comptent ; avec le SDS, la séparation dépend de la masse.

📖 3. Manipulation et analyse de l’hémoglobine

★ À maîtriser

📌 L’HbS migre moins loin et moins vite que l’HbA, car le remplacement du glutamate chargé négativement par une valine apolaire réduit sa charge et favorise des agrégats fibreux qui ralentissent sa migration.

• Dans l’HbS, la valine remplace le glutamate en position 6 de la chaîne β à la suite d’une mutation ponctuelle du gène codant cette chaîne.

📌 Un individu atteint de drépanocytose possède le génotype S//S, tandis qu’un individu non atteint possède le génotype A//A ou A//S.

Compléments

• 🔄 L’utilisation de la micropipette comporte trois étapes :

  1. Appuyer jusqu’au premier cran pour prélever
  2. Appuyer jusqu’au deuxième cran pour expulser toute la solution dans le puits
  3. Éjecter le cône après le dépôt

• Dans le protocole d’électrophorèse de l’hémoglobine, la migration dure 15 à 20 minutes et les dépôts comprennent HbA, HbA avec SDS, HbS et HbS avec SDS.

• La dénaturation de l’hémoglobine sépare ses quatre chaînes protéiques reliées par des liaisons faibles ; ces chaînes plus légères migrent plus loin et à la même vitesse, donnant une bande unique.

💡 Astuce mémo

Glu chargé remplacé par Val apolaire → HbS moins chargée et agrégée → migration réduite.

📖 4. Interprétation des protéines de l’œuf

★ À maîtriser

• À pH 9,2, les radicaux de la lysine et de l’arginine sont chargés positivement, ceux de l’histidine sont neutres, et ceux de l’acide aspartique et de l’acide glutamique sont chargés négativement.

• À pH 9,2, la charge approximative de l’ovalbumine est −12 et elle migre vers le pôle positif.

📌 À pH 9,2, une protéine qui migre vers le pôle positif est chargée négativement et possède un pHi inférieur à 9,2.

Compléments

📌 À pH 9,2, une protéine qui migre vers le pôle négatif est chargée positivement et possède un pHi supérieur à 9,2.

• Sur l’électrophorégramme des protéines de l’œuf à pH 9,2, la bande 1 correspond à l’ovalbumine, abondante et ayant fortement migré, tandis que la bande 1′ est attribuée avec incertitude à l’ovomucoïde, peu abondante et ayant fortement migré.

• Sur l’électrophorégramme des protéines de l’œuf à pH 9,2, la bande 3 est attribuée à la conalbumine, plus lourde et moins abondante que l’ovalbumine, la bande 2 à l’ovoinhibiteur et à l’ovomucine, et la bande 4 au lysozyme.

📖 5. Caractérisation des protéines

★ À maîtriser

• La cristallographie aux rayons X et la spectroscopie par RMN sont citées comme techniques de détermination de la structure tridimensionnelle des protéines.

Compléments

• Le cours nomme le séquençage et le profil d’hydropathie parmi les techniques de caractérisation des protéines, sans en préciser ici les méthodes.

• Le profil d’hydropathie présenté distingue des parties hydrophiles et une hélice α hydrophobe associée à une succession de 20 acides aminés hydrophobes.

📖 6. Analyse fonctionnelle et expérimentale

★ À maîtriser

📌 Une protéine native de plus de 300 kDa constituée de deux unités de 170 kDa se dissocie sous l’action du SDS en ces deux unités, chacune constituée de deux chaînes d’environ 80 kDa reliées par des ponts disulfure éliminés par le mercaptoéthanol.

📌 La protéine M1 de 65 kDa est composée des sous-unités M2 de 45 kDa et M3 de 20 kDa, associées par des liaisons faibles.

• Chez le témoin possédant IKK, IkB est d’abord non phosphorylée, une partie est phosphorylée après 5 minutes, puis aucune forme d’IkB n’est détectée après 10 minutes.

📌 Chez le mutant dépourvu d’IKK, IkB est beaucoup moins phosphorylée après 5 minutes et la forme non phosphorylée reste présente après 10 minutes, ce qui soutient l’hypothèse qu’IKK catalyse la phosphorylation d’IkB et que cette phosphorylation entraîne son élimination.

• Dans les fibroblastes transgéniques, l’introduction du gène PINK1 est associée à la présence de PINK1 et de p-Parkin, ce qui soutient l’hypothèse que PINK1 catalyse la phosphorylation de Parkin.

📌 Le domaine extracellulaire d’Izumo se fixe à la protéine Juno présente à la surface des ovocytes, et l’inactivation du gène Juno empêche la fécondation dans l’expérience décrite. - Bianchi et al, Nature, 2014

Compléments

• Dans l’expérience sur la LGC, le bleu de Coomassie ne révèle pas la protéine pure insuffisamment concentrée, alors que des anticorps anti-LGC radioactifs permettent de détecter de très petites quantités de cette protéine.

• Dans l’expérience sur la LGC, les formes lourde et légère observées ont respectivement une masse de 50 kDa et de 40 kDa.

• Dans l’expérience sur la LGC, une cellule transgénique peut ne présenter aucun signal détectable si l’allèle introduit ne s’exprime pas ou s’il code une protéine anormale non reconnue par les anticorps anti-LGC.

• Les résultats d’électrophorèse indiquent que N s’associe à M1 par l’intermédiaire de la sous-unité M3, car N+M1 et N+M3 migrent plus lentement que N seule, contrairement à N+M2.

• L’actine sert de témoin de charge pour vérifier que des quantités comparables de protéines ont été déposées dans les puits.

• Dans les neurones exposés à la roténone, l’épaisseur des bandes PINK1 et p-Parkin augmente avec la concentration de roténone, sans que ces résultats établissent le mécanisme ni un lien causal entre les deux protéines.

• Dans l’expérience sur l’hémoglobine, l’augmentation de la dose d’AHSP accroît la quantité d’hémoglobine formée en conditions non dénaturantes, tandis qu’en conditions dénaturantes la totalité de l’α-globine radioactive migre quelle que soit la dose d’AHSP.

• La protéine Juno de souris stérile est décrite avec 7 hélices α, 3 feuillets β et plusieurs régions sans structure secondaire, dans une structure tertiaire plutôt globulaire.

• La protéine Juno de souris stérile présente une conformation différente, notamment par la position de ses régions 1, 2 et 3, et pourrait ainsi interagir incorrectement avec Izumo.