Fiche de révision : Électrophorèse et Western Blot

📋 Plan du Cours

1. Protéome et complexité des protéines
2. Milieux biologiques et matrice
3. Anticorps et reconnaissance des antigènes
4. Western Blot et SDS-PAGE
5. Électrophorèse native des protéines
6. Transfert et révélation par Western Blot
7. Applications et interprétation du Western Blot
8. Électrophorèse bidimensionnelle
9. Séparation par chromatographie
10. Détection in situ des protéines
11. Dosage des protéines totales
12. Immunodosage en phase liquide
13. Immunodosages ELISA en phase solide
14. Immunométrie sandwich et dosage de l’HCG

📖 1. Protéome et complexité des protéines

★ À maîtriser

• Le génome nucléaire comprend environ 20 000 à 30 000 gènes, tandis que le protéome comprend environ 500 000 protéines différentes.

📌 Le génome est stable, tandis que le transcriptome et le protéome sont dynamiques.

📌 Toutes les cellules possèdent le même génome, mais les gènes ne sont pas exprimés de la même manière dans tous les tissus.

Compléments

• L’expression de l’information génétique passe du génome à l’ARN messager, puis aux protéines qui constituent le protéome.

• Les modifications post-traductionnelles contribuent à la diversité du protéome, qui compte environ 500 000 protéines pour 20 000 à 30 000 gènes.

• Les protéines sont difficiles à étudier parce qu’elles ne sont pas amplifiables, sont très hétérogènes et présentent de grandes différences de concentration.

💡 Astuce mémo

Génome → transcriptome → protéome : de l’ADN aux protéines

📖 2. Milieux biologiques et matrice

🔑 Notions clés & Définitions

• Matrice : Milieu biologique dans lequel les protéines sont dosées.

★ À maîtriser

• Les protéines peuvent être étudiées dans les milieux biologiques suivants :
  • Plasma ou sérum
  • Urines
  • Liquide céphalo-rachidien
  • Liquides d’épanchement
  • Tissus ou biopsies
  • Cellules en culture
  • Extraits bactériens
  • Surnageants de culture cellulaire

📌 Les méthodes de dosage des protéines doivent être adaptées à la matrice analysée.

Compléments

• Le plasma ou le sérum peut être obtenu par prise de sang après séparation des cellules sanguines du surnageant.

• Le liquide céphalo-rachidien est prélevé par ponction lombaire.

📖 3. Anticorps et reconnaissance des antigènes

🔑 Notions clés & Définitions

• Antigène : Protéine reconnue par le système immunitaire et susceptible d’être détectée par des anticorps.

• Épitope : Région exposée et immunogénique d’une protéine, susceptible d’être reconnue par un anticorps spécifique, et constituée d’environ 12 à 20 acides aminés.

★ À maîtriser

• Les régions hypervariables des chaînes lourdes et légères déterminent la spécificité de reconnaissance d’un épitope, et chaque anticorps possède deux sites de reconnaissance du même antigène.

📌 Les anticorps polyclonaux reconnaissent plusieurs épitopes d’une même protéine, tandis qu’un anticorps monoclonal correspond à un seul type d’anticorps dirigé contre un épitope unique.

Compléments

• Un anticorps, ou immunoglobuline, est formé de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères reliées par des ponts disulfures.

• Le fragment Fc est la région constante de l’anticorps, porte la fonction de transduction du signal et sert à détecter les anticorps.

📖 4. Western Blot et SDS-PAGE

★ À maîtriser

• Le Western Blot détecte, à l’aide d’anticorps, une protéine immobilisée sur une membrane et constitue une technique séparative, qualitative et semi-quantitative.

• 🔄 Le Western Blot se déroule en trois étapes :

  1. Séparation des protéines par SDS-PAGE.
  2. Transfert des protéines sur une membrane sous l’effet d’un courant.
  3. Révélation par hybridation avec des anticorps primaires puis secondaires.

• En SDS-PAGE, le SDS dénature les protéines en rompant leurs liaisons faibles et leur confère une charge négative, de sorte qu’elles sont séparées selon leur taille plutôt que selon leur charge initiale.

• La séparation en SDS-PAGE dépend de la taille des protéines, du pourcentage de polyacrylamide et du tampon utilisé.

• À 7 % de polyacrylamide, la séparation des protéines assez grosses, entre 150 et 250 kDa, est bonne, tandis qu’à 18 %, la séparation des grosses protéines n’est plus visible.

Compléments

• Le SDS ne rompt pas les ponts disulfures ; le DTT, agent réducteur ajouté pour une dénaturation plus complète, les rompt et sépare les monomères et les chaînes peptidiques.

• Le gel de polyacrylamide forme un maillage qui sépare les protéines selon leur taille : les plus petites migrent plus facilement et se retrouvent en bas du gel, tandis que les plus grosses restent plus haut.

📌 Plus le polyacrylamide est concentré, plus ses maillages sont serrés et plus il permet de séparer les protéines de petite taille.

• Le marqueur de poids moléculaire est constitué de protéines de masses connues, exprimées en kDa, qui migrent sur le gel et sont colorées pour servir d’échelle.

📌 Le pourcentage de polyacrylamide doit être adapté aux protéines que l’on veut étudier.

📐 Formule - La masse moyenne d’un acide aminé est approximativement $110\ \mathrm{Da}=0{,}11\ \mathrm{kDa}$ ; ainsi, 200 acides aminés correspondent à 22 kDa et 300 acides aminés à 33 kDa.

• En SDS-PAGE, l’insuline se sépare en deux chaînes.

💡 Astuce mémo

Séparer sur gel → transférer sur membrane → révéler avec des anticorps

📖 5. Électrophorèse native des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• Électrophorèse native : L’électrophorèse native est une séparation des protéines qui préserve leurs structures tertiaires et parfois quaternaires, ainsi que leurs complexes protéiques associés.

★ À maîtriser

• En électrophorèse native, les protéines se séparent selon plusieurs paramètres, notamment leur charge, leur forme et leur taille.

Compléments

• L’électrophorèse native permet d’étudier les complexes protéiques, le nombre de monomères associés et le nombre de chaînes polypeptidiques.

• En électrophorèse native, l’insuline forme une seule bande dont la masse est égale à la somme des masses de ses chaînes A et B.

💡 Astuce mémo

SDS dénature et trie par taille ; le natif préserve les complexes et combine taille, forme et charge.

📖 6. Transfert et révélation par Western Blot

★ À maîtriser

• Le Western Blot consiste à transférer les protéines sur une membrane, saturer les sites non spécifiques, incuber avec un anticorps primaire, laver, incuber avec un anticorps secondaire marqué, laver puis révéler le marqueur.

• La peroxydase HRP transforme le luminol en lumière en présence d’eau oxygénée, et la lumière émise révèle les complexes antigène-anticorps.

Compléments

• Le transfert sur membrane de nitrocellulose ou de PVDF arrête les protéines, qui y sont retenues après leur migration électrique du − vers le +.

• La saturation bloque les sites de fixation non spécifiques de la membrane et peut être réalisée avec de la BSA ou du lait.

• L’anticorps secondaire reconnaît le Fc de l’anticorps primaire de façon spécifique à l’espèce de celui-ci.

• Lors d’une révélation au luminol, la lumière impressionne un film radiosensible proportionnellement à son intensité et produit des taches noires.

💡 Astuce mémo

Saturer → primaire → laver → secondaire → laver → révéler

📖 7. Applications et interprétation du Western Blot

🔑 Notions clés & Définitions

• Fluorochrome : Un fluorochrome est une molécule qui, après excitation à une longueur d’onde, réémet de la lumière à une longueur d’onde supérieure.

★ À maîtriser

• Le multiplexage permet de détecter plusieurs protéines simultanément avec des anticorps primaires différents et des anticorps couplés à des fluorochromes distincts.

📌 Dans l’exemple présenté, la quantité d’AKT reste globalement constante quelles que soient les conditions, tandis que celle de p-AKT varie selon les conditions.

Compléments

• Dans une analyse par Western Blot, une quantité de lumière plus importante indique une quantité de protéines plus élevée.

• Les anticorps permettent une détection spécifique des protéines, y compris des protéines modifiées après une modification post-traductionnelle, et peuvent servir à étudier des voies de signalisation.

• Dans l’exemple de Western Blot présenté, AKT sert à la normalisation, l’insuline indique si les souris ont été stimulées, la ligne supérieure renseigne sur leur statut homozygote ou hétérozygote pour une maladie, et p-AKT montre la présence et la quantité de ce complexe en tenant compte de ces paramètres.

• Le Western Blot est une méthode qualitative et semi-quantitative, très utilisée en recherche mais relativement peu utilisée en routine hospitalière car elle est fastidieuse.

• Le Western Blot peut confirmer une séroconversion au VIH en recherchant des anticorps anti-VIH et des antigènes viraux, notamment l’antigène p24, qui est le marqueur le plus précoce cité.

• Pour confirmer un diagnostic de VIH, le test est souvent répété 2 jours après afin de suivre la cinétique de différentes protéines virales.

📖 8. Électrophorèse bidimensionnelle

🔑 Notions clés & Définitions

• Électrophorèse bidimensionnelle : L’électrophorèse bidimensionnelle sépare les protéines selon leur point isoélectrique puis leur poids moléculaire, notamment pour distinguer des protéines de même masse.

★ À maîtriser

• La première dimension est une électrofocalisation dans un gradient de pH, suivie d’une électrophorèse SDS-polyacrylamide dans la deuxième dimension.

• Lors de l’électrofocalisation, les protéines migrent dans le gradient de pH tant qu’elles sont chargées, puis s’immobilisent lorsqu’elles atteignent leur pHi où elles sont électriquement neutres.

• La séparation en deux dimensions améliore la résolution : deux protéines confondues si elles sont séparées uniquement selon leur pHi peuvent être distinguées selon leur poids moléculaire.

Compléments

• Dans le gradient de pH de l’électrofocalisation, les protéines acides migrent vers le pôle positif et les protéines basiques vers le pôle négatif.

• La deuxième dimension sépare les protéines selon leur poids moléculaire et peut révéler que deux protéines ayant le même pHi ont des poids moléculaires différents.

• L’électrophorèse bidimensionnelle produit des spots plutôt que des bandes, et chaque spot correspond à une protéine ou à un monomère.

📖 9. Séparation par chromatographie

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie : La chromatographie est une méthode séparative, qualitative et quantitative, cette dernière caractéristique reposant sur la hauteur des pics obtenus.

📝 Points essentiels

• En chromatographie, un mélange complexe d’analytes est entraîné par une phase mobile liquide ou gazeuse à travers une phase stationnaire, généralement solide et dotée de propriétés de fixation propres ; l’élution correspond à la sortie de la colonne.

• En gel filtration, les billes poreuses de la phase stationnaire retiennent les petites molécules, tandis que les grosses protéines ne sont pas retenues et sortent avant les molécules moyennes puis les petites.

• En chromatographie échangeuse d’anions, la phase stationnaire est chargée positivement et retient les protéines négatives, notamment celles dont le pHi est faible ; l’ordre d’élution va des pHi les plus élevés aux pHi les plus faibles.

• En chromatographie échangeuse de cations, la phase stationnaire est chargée négativement et retient les protéines positives, notamment les protéines basiques ; l’ordre d’élution va des pHi les plus faibles aux pHi les plus élevés.

📖 10. Détection in situ des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• Détection in situ : La détection in situ consiste à détecter les protéines directement dans les tissus, notamment en anatomopathologie, afin de déterminer leur localisation exacte, par exemple membranaire ou nucléaire.

★ À maîtriser

• En immunohistochimie, une biopsie est préparée en coupe fine de 5 microns, puis le tissu est perméabilisé et chauffé pour démasquer les antigènes avant la détection des épitopes par des anticorps primaires puis secondaires.

Compléments

• En immunohistochimie, la HRP conjuguée à l’anticorps secondaire produit un marquage marron lorsque les protéines sont présentes en quantité importante.

• Dans une tumeur du sein, le marquage marron de HER2 à la membrane de certaines cellules permet d’évaluer son niveau d’expression, associé à une prise en charge différente selon que la tumeur amplifie ou non la tyrosine kinase.

• L’immunohistochimie utilise un seul marqueur à la fois, tandis que l’immunofluorescence emploie des anticorps couplés à des fluorochromes excités à différentes longueurs d’onde.

📖 11. Dosage des protéines totales

★ À maîtriser

• La réaction de Bradford dose les protéines totales en formant un complexe coloré entre le bleu de Coomassie et les protéines, principalement par interaction avec les résidus d’arginine, et non avec les liaisons peptidiques ; le colorant passe du marron au bleu et l’absorbance est mesurée à 595 nm.

📐 Formule - Selon la loi de Beer-Lambert, l’absorbance est proportionnelle à la concentration : $A = k \times C$.

• La réaction de Biuret dose les protéines totales, notamment celles qui circulent dans le sang, en formant en milieu alcalin un complexe coloré entre les liaisons peptidiques et le cuivre ; le complexe violet absorbe à 540 nm.

Compléments

📌 Le dosage des protéines totales peut être réalisé par la méthode de Bradford ou par la méthode du Biuret, tandis que les immunodosages servent à doser des protéines spécifiques.

• Pour déterminer une concentration par Bradford, on mesure l’absorbance d’étalons d’albumine de concentrations connues, on trace l’absorbance en fonction de la concentration, puis on détermine la concentration de l’échantillon à partir de son absorbance.

• La méthode de Bradford est sensible, mais son dosage devient inexact lorsque la concentration dépasse la zone de linéarité de la courbe d’étalonnage.

📖 12. Immunodosage en phase liquide

📝 Points essentiels

• Un immunodosage en phase liquide dose une protéine spécifique en faisant reconnaître ses épitopes par des anticorps en solution, dont certains relient deux protéines pour former un réseau antigène-anticorps trouble.

📌 La turbidimétrie mesure la lumière qui traverse la solution : lorsque la concentration en protéines augmente, le trouble augmente et la lumière transmise diminue.

📌 La néphélémétrie, plus sensible que la turbidimétrie et privilégiée pour l’analyse, mesure la lumière dispersée par le trouble, qui augmente avec la concentration en protéines.

• En néphélémétrie, la lumière diffusée par les complexes augmente avec le trouble de la solution, et le signal est proportionnel à la concentration en protéine.

💡 Astuce mémo

La turbidimétrie regarde la lumière qui traverse ; la néphélémétrie, celle qui est dispersée.

📖 13. Immunodosages ELISA en phase solide

📝 Points essentiels

• En ELISA, l’antigène ou l’anticorps est immobilisé sur une phase solide, qui peut être une plaque ou des billes, ces dernières étant plus courantes dans les automates.

📌 En ELISA direct, un anticorps reconnaît l’antigène immobilisé, tandis qu’en ELISA indirect un anticorps secondaire reconnaît l’anticorps primaire.

• En ELISA direct, le signal augmente avec la quantité d’antigène immobilisé et d’anticorps qui s’y fixe.

• En ELISA indirect, le signal peut servir à mesurer l’antigène ou, lorsque l’antigène est immobilisé, à détecter et quantifier les anticorps qui s’y fixent.

• Pour rechercher une allergie au lait par ELISA indirect, le sang du patient est appliqué sur une plaque portant différents allergènes, puis les anticorps du patient qui se fixent à l’allergène correspondant sont détectés et quantifiés.

📖 14. Immunométrie sandwich et dosage de l’HCG

★ À maîtriser

• L’ELISA sandwich détecte une protéine prise entre deux anticorps, et le signal obtenu est proportionnel à la concentration en antigène.

• L’ELISA sandwich ne peut révéler que les protéines suffisamment grosses et possédant au moins deux épitopes.

• L’anticorps de capture reconnaît un premier épitope pour immobiliser la protéine, tandis que l’anticorps de détection ou de révélation reconnaît un second épitope pour la révéler.

• La chaîne alpha de l’HCG est partagée avec d’autres hormones de la reproduction comme la LH et la FSH, tandis que sa chaîne bêta varie et permet un dosage spécifique de l’HCG.

Compléments

• L’HCG, hormone détectée lors des tests de grossesse, est un dimère constitué d’une chaîne alpha et d’une chaîne bêta.

• Dans le cancer des testicules, un excès de chaîne bêta libre d’HCG peut être produit et dosé pour le suivi du cancer.

• Pour doser la chaîne bêta libre d’HCG, un anticorps de capture reconnaît un épitope exposé dans la forme totale afin de capturer la protéine, puis un anticorps de révélation se fixe sur un autre épitope.