QCM : Électrophorèse et Western Blot (27 questions)

Explication

La phase solide peut être une plaque ou des billes, ces dernières étant fréquentes dans les automates. En format direct, un anticorps reconnaît l’antigène immobilisé et le signal augmente avec la quantité d’antigène et d’anticorps fixés. En format indirect, l’anticorps secondaire reconnaît l’anticorps primaire. Le signal du format direct augmente avec la quantité d’antigène immobilisé, et non l’inverse.

Explication

Le multiplexage distingue plusieurs cibles grâce à des anticorps primaires différents et des fluorochromes distincts. Un fluorochrome réémet à une longueur d’onde supérieure, et l’intensité lumineuse reflète la quantité de protéines ; des anticorps spécifiques permettent aussi l’étude des protéines modifiées et des voies de signalisation. L’emploi d’un seul fluorochrome commun ne correspond pas au multiplexage décrit.

Explication

Le génome nucléaire compte environ 20 000 à 30 000 gènes, alors que le protéome comprend environ 500 000 protéines différentes. Le génome est stable, contrairement au transcriptome et au protéome qui sont dynamiques.

Explication

AKT reste globalement constant et sert à la normalisation, alors que p-AKT varie et renseigne sur le complexe. Le Western Blot est qualitatif et semi-quantitatif, relativement peu utilisé en routine hospitalière car fastidieux ; p24 est le marqueur précoce cité. La ligne d’insuline indique la stimulation des souris, tandis que leur statut génétique est indiqué par la ligne supérieure.

Explication

L’immunohistochimie utilise une coupe de tissu d’environ 5 microns, puis une perméabilisation et un chauffage pour démasquer les antigènes avant les anticorps primaires puis secondaires. La détection in situ renseigne sur la localisation de la protéine, et la HRP conjuguée à l’anticorps secondaire donne un marquage marron lorsque la protéine est abondante.

Explication

Un antigène est une protéine reconnue par le système immunitaire et susceptible d’être détectée par des anticorps. L’épitope est une région exposée et immunogénique de cette protéine, d’environ 12 à 20 acides aminés ; il ne désigne ni l’antigène entier ni l’antigène lui-même.

Explication

La chromatographie est séparative et qualitative, et la phase mobile entraîne le mélange à travers la phase stationnaire. La quantification repose sur la hauteur des pics, l’élution correspond à la sortie de la colonne et la phase stationnaire est généralement solide avec des propriétés de fixation propres.

Explication

Le SDS rompt les liaisons faibles et charge négativement les protéines, tandis que le DTT réduit les ponts disulfures ; le SDS ne les rompt pas lui-même. Le gel de polyacrylamide trie les protéines selon leur taille, les plus petites migrant plus facilement vers le bas, et l’insuline donne deux chaînes en SDS-PAGE.

Explication

Les anticorps polyclonaux reconnaissent plusieurs épitopes d’une même protéine, tandis qu’un anticorps monoclonal est un seul type dirigé contre un épitope unique. Les propositions qui attribuent ces caractéristiques à la classe opposée confondent les deux préparations.

Explication

En SDS-PAGE, les petites protéines migrent plus facilement à travers le gel, tandis que les plus grosses se retrouvent en haut. Un gel plus concentré resserre les maillages et favorise la séparation des petites protéines. Le marqueur coloré, constitué de protéines de masses connues exprimées en kDa, fournit une échelle. La séparation dépend aussi du pourcentage de polyacrylamide et du tampon utilisé.

Explication

L’expression suit l’ordre génome, ARN messager, puis protéines constituant le protéome. Les modifications post-traductionnelles contribuent à la diversité, et le protéome compte environ 500 000 protéines pour 20 000 à 30 000 gènes.

Explication

Pour une protéine compatible avec le format sandwich, le signal est proportionnel à la concentration en antigène. La méthode exige cependant une protéine suffisamment grosse possédant au moins deux épitopes : la protéine décrite, qui n’en a qu’un, ne satisfait pas cette condition.

Explication

L’électrophorèse bidimensionnelle sépare d’abord selon le point isoélectrique, puis selon le poids moléculaire ; la première séparation peut donc distinguer les protéines de même masse si leurs pHi diffèrent. L’électrofocalisation est la première dimension, tandis que la SDS-polyacrylamide constitue la seconde et sépare selon la masse.

Explication

Les anticorps en solution reconnaissent les épitopes, et certains établissent des ponts entre protéines, créant un réseau trouble. La reconnaissance concerne les épitopes, pas les liaisons peptidiques, et le principe décrit est en phase liquide plutôt que sur une phase solide.

Explication

Pour une protéine de 250 acides aminés, l’estimation donne $250 \times 0{,}11 = 27{,}5$ kDa. Le gel doit être choisi selon les protéines étudiées : à 7 %, il sépare bien les protéines assez grosses entre 150 et 250 kDa, tandis qu’à 18 %, la séparation des grosses protéines n’est plus visible.

Explication

L’immunohistochimie utilise un marqueur à la fois, tandis que l’immunofluorescence repose sur des anticorps couplés à des fluorochromes excités à différentes longueurs d’onde. Le marquage membranaire de HER2 permet d’évaluer son expression, laquelle intervient dans la prise en charge selon l’amplification de la tyrosine kinase.

Explication

En conditions natives, l’insuline migre sous la forme d’une bande dont la masse additionne celles des chaînes A et B. L’électrophorèse native peut aussi servir à étudier les complexes, les monomères associés et les chaînes polypeptidiques ; les autres propositions attribuent une séparation des chaînes ou restreignent à tort cet intérêt.

Explication

Dans cet exemple, le sang est appliqué sur une plaque présentant différents allergènes, puis les anticorps du patient fixés à l’allergène correspondant sont détectés et quantifiés. La plaque porte donc les allergènes, et non des anticorps ou une surface dépourvue d’allergènes.

Explication

Le Fc est la région constante de l’anticorps : il porte la fonction de transduction du signal et sert à détecter les anticorps. La reconnaissance spécifique de l’épitope relève des régions hypervariables, et non du Fc.

Explication

La néphélémétrie mesure la lumière dispersée, qui augmente avec le trouble et la concentration protéique ; elle est plus sensible que la turbidimétrie et privilégiée pour l’analyse. La mesure de la lumière transmise caractérise la turbidimétrie.

Explication

La relation est $A = k \times C$, et la calibration trace l’absorbance en fonction de la concentration d’étalons connus. On utilise ensuite l’absorbance de l’échantillon pour en déduire sa concentration ; la relation n’est pas inverse.

Explication

Le Western Blot détecte par des anticorps une protéine immobilisée sur une membrane et comporte la séparation par SDS-PAGE, puis le transfert et la révélation par anticorps primaires et secondaires. Il est séparatif, qualitatif et semi-quantitatif ; le SDS charge négativement les protéines afin qu’elles soient séparées selon leur taille.

Explication

La HRP convertit le luminol en lumière en présence d’eau oxygénée, ce qui révèle les complexes antigène-anticorps. Le secondaire reconnaît le Fc du primaire en fonction de l’espèce de ce dernier ; le film donne des taches noires, et la spécificité d’espèce ne dépend pas du secondaire.

Explication

La matrice est le milieu où le dosage des protéines est réalisé. Parmi les milieux possibles figurent les urines, le liquide céphalo-rachidien, les tissus, les biopsies, les extraits bactériens et les surnageants de culture cellulaire.

Explication

La matrice est le milieu dans lequel les protéines sont dosées, et les méthodes de dosage doivent être adaptées à ce milieu. Le liquide céphalo-rachidien est prélevé par ponction lombaire, tandis que le plasma ou le sérum est obtenu par prise de sang après séparation des cellules sanguines du surnageant. Une méthode utilisée pour le plasma ne peut donc pas être présumée adaptée à toute autre matrice. L’adaptation de la méthode dépend aussi du milieu analysé.

Explication

L’électrophorèse native préserve la structure tertiaire et parfois la structure quaternaire des protéines, ainsi que les complexes associés. Elle sépare les protéines selon plusieurs paramètres, notamment leur charge, leur forme et leur taille. Elle ne les classe donc pas selon leur seule masse ni selon leur pourcentage de polyacrylamide, et ne dissocie pas les complexes avant la migration.

Explication

Les anticorps sont constitués de deux chaînes lourdes et de deux chaînes légères reliées par des ponts disulfures. La spécificité pour un épitope dépend des régions hypervariables des chaînes lourde et légère ; les sites d’un anticorps reconnaissent le même antigène, et non deux antigènes différents.