Fiche de révision : Enzymologie : catalyseurs et isoenzymes

📋 Plan du Cours

1. Catalyseurs et mécanisme enzymatique
2. Biosynthèse et maturation enzymatiques
3. Holoenzymes et coenzymes
4. Isoenzymes et exemples biologiques
5. PAM et amidation des peptides
6. Isoenzymes de la PAM
7. Isoenzymes et formes de la PAM
8. Mécanisme de l’amidation peptidique
9. Paramètres de la cinétique enzymatique
10. Énergie et facteurs de réaction
11. Température et pH enzymatiques
12. PCR et amplification de l’ADN
13. Complexe enzyme-substrat et site actif
14. Complémentarité et modification du substrat
15. Inhibiteurs irréversibles
16. Inhibiteurs réversibles et EGFR
17. Mutations activatrices de l’EGFR
18. Thérapeutiques ciblant l’EGFR

📖 1. Catalyseurs et mécanisme enzymatique

🔑 Notions clés & Définitions

• Catalyseur : Substance qui accélère une réaction chimique en diminuant l’énergie d’activation nécessaire à la transformation des réactants en produits.
• Enzyme : Catalyseur biologique qui accélère les réactions des organismes en diminuant leur énergie d’activation.

★ À maîtriser

• La majorité des enzymes sont des protéines, représentant 95 % des enzymes, tandis que certains ARN enzymatiques sont appelés ribozymes.

• 🔄 La réaction enzymatique suit cette séquence:

  1. L’enzyme rencontre le substrat
  2. Le substrat se fixe et forme le complexe enzyme-substrat
  3. Le complexe se désagrège en libérant le produit et l’enzyme

Compléments

• La kinase phosphoryle le glucose en glucose-6-phosphate en prélevant un phosphate de l’ATP et en le transférant au glucose.

💡 Astuce mémo

Énergie d’activation diminuée → réaction accélérée

📖 2. Biosynthèse et maturation enzymatiques

★ À maîtriser

• 🔄 La biosynthèse classique comprend les étapes suivantes:
  1. Transcription du gène en transcrit primaire
  2. Maturation du transcrit primaire en ARNm
  3. Traduction de l’ARNm en préprotéine
  4. Déplacement éventuel dans les organites membranaires
  5. Modifications post-traductionnelles
  6. Sécrétion éventuelle par exocytose

📌 L’épissage alternatif produit plusieurs ARNm à partir d’un même transcrit primaire, tandis que les modifications post-traductionnelles modifient une protéine déjà synthétisée.

• La synthèse de l’insuline commence par une préprohormone contenant les chaînes A et B reliées par le peptide C, puis une protéolyse retire le peptide C et produit l’insuline active formée des chaînes A et B reliées par deux ponts disulfures intercaténaires et un pont disulfure intracaténaire dans la chaîne A.

Compléments

• Les modifications post-traductionnelles protéolytiques comprennent les coupures par des endopeptidases à l’intérieur de la protéine et par des exopeptidases à ses extrémités N-terminales et C-terminales.

• La quantité de peptide C est équimolaire à la forme AB correspondant à l’insuline, ce qui permet de doser l’insuline sanguine avec un anticorps anti-peptide C.

💡 Astuce mémo

ADN → ARN → protéine → maturation

📖 3. Holoenzymes et coenzymes

🔑 Notions clés & Définitions

• Coenzyme : Molécule organique non protéique qui participe directement à une réaction enzymatique et peut être indispensable à la catalyse.

★ À maîtriser

📌 Une enzyme purement protéique est constituée uniquement d’acides aminés, tandis qu’une holoenzyme associe une apoenzyme protéique et un cofacteur non protéique indispensable à l’activité enzymatique.

• Les exemples d’atomes métalliques sont:
  • le magnésium
  • le fer
  • le manganèse
  • le cuivre
  • le zinc

📌 Les coenzymes activateurs sont des groupements prosthétiques fortement liés par des liaisons covalentes à l’apoenzyme, tandis que les coenzymes transporteurs sont des co-substrats qui se dissocient facilement.

Compléments

• L’aminoacyl-transférase utilise l’ATP comme coenzyme pour fixer un acide aminé sur un ARNt selon la réaction $ARNt + acide aminé + ATP \rightarrow ARNt-AA + ADP + Pi$.

💡 Astuce mémo

Apoenzyme = protéique ; cofacteur = non protéique

📖 4. Isoenzymes et exemples biologiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Isoenzyme : Forme moléculaire différente d’une enzyme qui catalyse la même réaction que d’autres formes de la même enzyme.

★ À maîtriser

📐 Formule — La lactate déshydrogénase catalyse la réaction réversible $Lactate + NAD^+ \leftrightarrow Pyruvate + NADH + H^+$, dans laquelle le lactate perd deux atomes d’hydrogène pour donner du pyruvate.

• La LDH est un tétramère formé de chaînes M et H codées par des gènes différents, la chaîne M étant prédominante dans le muscle et la chaîne H dans le cœur.

Compléments

• Les isoenzymes peuvent provenir de gènes différents ou d’un épissage alternatif.

• Les cinq isoenzymes de la LDH sont:

  • H4
  • M1-H3
  • M2-H2
  • M3-H1
  • M4

• 🔄 Le western blot comprend les étapes suivantes:
  1. Séparation des protéines par électrophorèse
  2. Transfert sur une membrane de nitrocellulose
  3. Reconnaissance par des anticorps anti-LDH
  4. Détection par des anticorps secondaires couplés à une peroxydase

📖 5. PAM et amidation des peptides

🔑 Notions clés & Définitions

• PAM : La seule enzyme qui catalyse l’alpha-amidation en C-terminal des peptides, une modification post-traductionnelle essentielle à l’activité biologique de nombreux peptides.

★ À maîtriser

• La PAM est bifonctionnelle et possède une activité monooxygénase ainsi qu’une activité lyase.

• Environ 70 % des peptides sont amidés et possèdent un groupe CO-NH2 C-terminal chargé positivement à pH physiologique, tandis que 30 % ne sont pas amidés et possèdent un groupe COOH chargé négativement.

Compléments

• Un seul gène complexe situé sur le chromosome 5 humain en position 5q14-24 code pour la PAM, et l’épissage alternatif produit plusieurs formes d’ARN messager et plusieurs formes protéiques.

• La PAM humaine comporte environ 900 acides aminés et 27 exons, avec un domaine PHM N-terminal codé par les 12 premiers exons et un domaine PAL C-terminal codé par 8 exons.

• Le motif Lys-Lys, codé par l’exon 16, peut être reconnu par des endopeptidases qui séparent les activités PHM et PAL, tandis que son absence les maintient réunies.

💡 Astuce mémo

PHM oxyde ; PAL clive

📖 6. Isoenzymes de la PAM

★ À maîtriser

📌 Les formes membranaires de la PAM possèdent le domaine transmembranaire DTM, tandis que les formes solubles en sont dépourvues et peuvent être sécrétées dans le sang.

Compléments

• Avant la sécrétion, les domaines actifs de la PAM membranaire se trouvent dans les granules de sécrétion, puis l’exocytose ancre la protéine à la membrane plasmique.

• Chez le rat, les formes membranaires comprennent rPAM-1, rPAM-2 et rPAM-3b, tandis que les formes solubles comprennent rPAM-3, rPAM-3a, rPAM-4 et rPAM-5.

💡 Astuce mémo

Formes membranaires avec DTM ; formes solubles sans DTM

📖 7. Isoenzymes et formes de la PAM

★ À maîtriser

📌 Les formes solubles de la PAM ne possèdent pas de domaine transmembranaire DTM et sont stockées dans les granules de sécrétion avant d’être sécrétées dans le sang après stimulation.

Compléments

• Les isoenzymes solubles humaines comprennent:
  • rPAM-3 : domaines PHM et PAL
  • rPAM-3a : domaines PHM et PAL
  • rPAM-4 : domaine PHM
  • rPAM-5

• Les formes membranaires humaines comprennent:
  • hPAM-D
  • hPAM-A
  • hPAM-B
  • hPAM-C
  • hPAM-E

💡 Astuce mémo

Forme soluble sans DTM, forme membranaire avec DTM

📖 8. Mécanisme de l’amidation peptidique

📝 Points essentiels

📌 La présence d’une glycine en C-terminal du peptide à amider est indispensable au signal d’amidation, car sans glycine la PAM ne peut pas fonctionner.

• L’amidation par la PAM se déroule en deux réactions successives catalysées par deux domaines enzymatiques différents : la PHM agit d’abord, puis la PAL.

• La PHM hydroxyle le carbone alpha de la glycine C-terminale du substrat peptidyl-AA-Gly pour former le peptidylglycine alpha-hydroxyglycine, dans les granules de sécrétion à 37 °C et à pH proche de 5,5 ± 0,5.

• La PHM nécessite les cofacteurs:

  • Cu2+
  • ascorbate
  • O2

📌 La PAL rompt la liaison entre le carbone alpha et l’amine de la glycine pour former un peptide amidé en C-terminal et du glyoxylate ; dans les granules acides la lyase est nécessaire, tandis qu’à pH basique dans le sang la rupture est spontanée.

💡 Astuce mémo

PHM hydroxyle, puis PAL lyse

📖 9. Paramètres de la cinétique enzymatique

🔑 Notions clés & Définitions

• Vitesse initiale : Quantité de produit formé ou de réactif disparu par unité de temps au début d’une réaction enzymatique.
• Vitesse maximale : Vitesse atteinte lorsque l’enzyme est saturée par le substrat.

• Constante de Michaelis : La constante de Michaelis Km est la concentration de substrat pour laquelle la vitesse de réaction atteint la moitié de Vmax ; pour une enzyme simple à un seul site de fixation, plus Km est faible, plus l’affinité pour le substrat est élevée.

📝 Points essentiels

• À faible concentration de substrat, les enzymes ne sont pas saturées et la vitesse est limitée par les molécules de substrat, tandis qu’à forte concentration de substrat les enzymes travaillent à leur capacité maximale et la vitesse est limitée par les molécules d’enzyme.

📐 Formule — La relation de Michaelis-Menten est $V_i = \frac{V_{max}[S]}{K_m+[S]}$.

💡 Astuce mémo

Faible [S] : enzyme excédentaire ; forte [S] : enzyme saturée

📖 10. Énergie et facteurs de réaction

🔑 Notions clés & Définitions

• Énergie d’activation : Quantité d’énergie nécessaire pour amener, à une température donnée, toutes les molécules d’une mole de substance à l’état de transition.

★ À maîtriser

📌 Les enzymes augmentent la vitesse des réactions chimiques en abaissant leur énergie d’activation et en facilitant l’accès des substrats à l’état de transition.

Compléments

• Pour la décomposition de l’eau oxygénée, l’énergie d’activation est:
  • 18 kcal/mol sans catalyseur ou enzyme
  • 12 kcal/mol avec du platine colloïdal
  • 6 kcal/mol avec la catalase

📌 La vitesse d’une réaction chimique est élevée lorsqu’une grande fraction des molécules se trouve dans l’état de transition riche en énergie, et faible lorsqu’une petite fraction s’y trouve.

• Une augmentation de la température de 10 °C double approximativement la vitesse d’une réaction chimique en augmentant la fraction de molécules ayant une énergie suffisante pour atteindre l’état de transition.

💡 Astuce mémo

Catalyse → énergie d’activation abaissée → vitesse augmentée

📖 11. Température et pH enzymatiques

★ À maîtriser

📌 L’activité enzymatique augmente avec la température jusqu’à une température optimale, puis diminue lorsque l’augmentation thermique provoque la dénaturation de l’enzyme.

• La Taq polymérase est une enzyme thermostable utilisée en PCR, stable jusqu’à 98 °C et présentant une température optimale de 68 à 72 °C.

📌 Une température de 60 à 100 °C provoque généralement une dénaturation irréversible avec perte de la forme globulaire et de l’activité, tandis qu’entre 45 et 60 °C la dénaturation peut être réversible avec récupération totale de l’activité après renaturation.

• Le pH optimal permet d’obtenir l’activité enzymatique maximale, tandis qu’en dehors de la zone de fonctionnement du système enzymatique l’activité est nulle.

Compléments

• La température optimale de la majorité des enzymes est proche de 37 à 38 °C.

• La pepsine fonctionne à pH environ 2, l’anhydrase carbonique et la trypsine à pH environ 8, et à pH 4 la pepsine perd la moitié de son activité.

💡 Astuce mémo

Température optimale : activité maximale ; température excessive : dénaturation

📖 12. PCR et amplification de l’ADN

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR : Réaction de polymérisation en chaîne qui amplifie une séquence d’ADN à partir d’une quantité infime d’ADN.

★ À maîtriser

• Le mélange réactionnel contient:
  • Matrice d’ADN
  • Amorce sens et amorce antisens
  • Taq polymérase
  • MgCl2 dans un tampon à pH 7
  • dATP, dGTP, dCTP et dTTP

• La PCR comprend une dénaturation initiale de 10 minutes à 94 °C, puis 30 à 45 cycles comprenant une dénaturation, une hybridation et une polymérisation, suivis d’une polymérisation finale de 10 minutes.

• Lors de la polymérisation de la PCR, la Taq polymérase synthétise l’ADN dans le sens 5’ vers 3’.

Compléments

• L’analyse électrophorétique d’un produit de PCR consiste à déposer les échantillons sur un gel d’agarose, à incuber le gel avec du BET, puis à révéler l’ADN sous lumière UV.

💡 Astuce mémo

Dénaturation, hybridation, polymérisation

📖 13. Complexe enzyme-substrat et site actif

🔑 Notions clés & Définitions

• Complexe enzyme-substrat : Résulte de la liaison spécifique des substrats au site actif de l’enzyme, dans des orientations favorables à la catalyse.
• Site actif : Région réduite de l’enzyme qui lie les substrats et contient les acides aminés participant directement à la catalyse.

★ À maîtriser

• Les complexes peuvent être mis en évidence par:

  • l’étude de la vitesse de réaction
  • la microscopie électronique
  • la spectroscopie

• À concentration constante d’enzyme, la vitesse de réaction augmente avec la concentration du substrat jusqu’à atteindre une vitesse maximale, ce qui démontre une interaction entre l’enzyme et le substrat.

• Le site actif est une entité tridimensionnelle créée par le repliement de la chaîne polypeptidique, de sorte que des résidus éloignés dans la séquence linéaire peuvent y interagir.

Compléments

• Dans le lysozyme, le groupe catalytique comprend les acides aminés 35, 52, 62, 63, 101 et 108 d’une séquence de 129 acides aminés.

• Les groupes catalytiques de trois protéases sont:

  • une cystéine et une histidine pour la papaïne
  • deux acides aspartiques pour la rénine
  • un acide glutamique et deux histidines, avec interaction avec Zn2+, pour la thermolysine

💡 Astuce mémo

Fixation du substrat → orientation favorable → catalyse

📖 14. Complémentarité et modification du substrat

★ À maîtriser

• La liaison du substrat au site actif dépend de la complémentarité de la disposition des atomes et repose sur des attractions non covalentes réversibles.

• Les interactions impliquées comprennent:

  • les liaisons électrostatiques
  • les liaisons hydrogène
  • les forces de Van der Waals
  • les interactions hydrophobes

• Lors de la catalyse, l’enzyme et le substrat échangent des électrons ou des atomes, le substrat atteint l’état de transition, puis devient rapidement le produit.

📌 Le modèle clé-serrure décrit une complémentarité directe entre l’enzyme et le substrat, tandis que le modèle de l’adaptation induite décrit une transconformation de l’enzyme après la liaison du substrat. — Fisher, 1890

Compléments

• Dans le modèle de l’adaptation induite appliqué à l’hexokinase, la fixation du glucose modifie la conformation de l’enzyme, qui transfère ensuite un phosphate de l’ATP au carbone 6 du glucose avant de se rouvrir pour libérer le glucose-6-phosphate.

💡 Astuce mémo

Clé-serrure : complémentarité directe ; adaptation induite : transconformation

📖 15. Inhibiteurs irréversibles

🔑 Notions clés & Définitions

• Inhibiteur irréversible : Forme une liaison covalente avec le site actif ou un groupe fonctionnel indispensable de l’enzyme, produisant un complexe enzyme-inhibiteur indissociable.

★ À maîtriser

• Les inhibiteurs irréversibles ciblent souvent l’hydroxyle d’une sérine ou le thiol d’une cystéine et provoquent une perte d’activité par modification de la conformation ou blocage du site actif.

• L’aspirine inhibe irréversiblement les cyclo-oxygénases en acétylant une sérine de leur site actif, ce qui réduit la synthèse des prostaglandines et des thromboxanes.

• La pénicilline agit comme un substrat suicide de la glycopeptide transpeptidase bactérienne : elle forme un acylenzyme très stable avec une sérine du site actif, ce qui arrête la synthèse de la paroi bactérienne et provoque la mort des bactéries.

📌 Après incubation avec l’iodoacétamide, la conservation de l’activité enzymatique indique que le site catalytique ne contient ni cystéine ni histidine, tandis que sa perte indique la présence d’une cystéine, d’une histidine ou des deux.

Compléments

• Les inhibiteurs irréversibles comprennent: les réactifs spécifiques de groupes catalytiques, les analogues de substrat, les inhibiteurs suicides

💡 Astuce mémo

Covalence → blocage du site actif → perte catalytique

📖 16. Inhibiteurs réversibles et EGFR

★ À maîtriser

• Un inhibiteur compétitif ressemble au substrat et se fixe au site actif à sa place, tandis qu’un inhibiteur non compétitif se fixe sur un autre site et modifie la conformation de l’enzyme.

• L’inhibition compétitive diminue la vitesse de catalyse mais peut être levée par une augmentation suffisante de la concentration du substrat.

• Dans l’inhibition non compétitive, l’inhibiteur peut se fixer à l’enzyme libre ou au complexe enzyme-substrat, et l’augmentation de la concentration du substrat ne permet pas de lever l’inhibition.

• L’inhibition compétitive augmente la constante apparente KM sans modifier Vmax, tandis que l’inhibition non compétitive diminue Vmax sans modifier KM.

• Le méthotrexate est un analogue structural du folate qui se lie à la dihydrofolate réductase 1000 fois plus fortement que le folate, inhibant la synthèse des nucléotides et la réplication cellulaire.

• Lors d’une intoxication aiguë au méthanol, l’éthanol agit comme inhibiteur compétitif de l’alcool déshydrogénase, qui métabolise préférentiellement l’éthanol en acétaldéhyde non toxique plutôt que le méthanol en formaldéhyde toxique.

• L’EGFR est un récepteur membranaire de l’EGF possédant un domaine tyrosine kinase cytosolique qui utilise l’ATP comme donneur de phosphate et est codé par les exons 18 à 24 du gène situé au locus 7p12 du chromosome 7.

• L’activation physiologique de l’EGFR suit la fixation du ligand, la dimérisation, la reconnaissance de l’ATP, l’autophosphorylation de huit tyrosines puis l’activation de voies de signalisation intracellulaire.

• Les mutations activatrices de l’EGFR sont impliquées dans 11 à 15 % des cancers bronchiques non à petites cellules et comprennent notamment Del E746-A750 sur l’exon 19 et L858R ou L858Q sur l’exon 21.

📌 Les mutations de l’EGFR rendent le domaine tyrosine kinase continuellement actif même en l’absence de ligand, ce qui active en permanence les trois voies de signalisation intracellulaire et favorise la transformation cancéreuse.

Compléments

• Les voies activées par l’EGFR sont: la voie MAPK, la voie STAT, la voie PI3K, selon la séquence PI3K → Akt → mTOR

💡 Astuce mémo

Compétitive : le substrat peut lever l’inhibition ; non compétitive : il ne le peut pas

📖 17. Mutations activatrices de l’EGFR

📝 Points essentiels

• L’EGFR est impliqué dans 11 à 15 % des cancers bronchiques non à petites cellules.

📌 Les deux mutations activatrices de l’EGFR sont mutuellement exclusives, ce qui signifie qu’elles ne peuvent pas être présentes simultanément.

• La mutation de l’exon 19, Del E746-A750, correspond à la délétion de cinq acides aminés et représente environ 45 % des mutations de l’EGFR.

• La mutation de l’exon 21 L858R ou L858Q touche la leucine en position 858, qui est remplacée respectivement par une arginine ou une glutamine, et représente environ 45 % des mutations de l’EGFR.

• Les mutations de l’EGFR rendent son domaine tyrosine kinase continuellement actif même en l’absence de ligand, ce qui active continuellement trois voies de signalisation intracellulaire et transforme la cellule en cellule cancéreuse.

💡 Astuce mémo

Exon 19 = délétion ; exon 21 = substitution

📖 18. Thérapeutiques ciblant l’EGFR

★ À maîtriser

📌 Les traitements dirigés contre l’EGFR muté visent à empêcher la prolifération de la cellule tumorale et à la diriger vers la mort cellulaire.

• Les inhibiteurs de l’EGFR de première génération sont des inhibiteurs réversibles compétitifs et des analogues de l’ATP dans son état de transition, comme le géfitinib et l’erlotinib.

• Les inhibiteurs de deuxième génération sont irréversibles et se lient de manière covalente aux cystéines 797, 805 et 803 du récepteur ; l’afatinib en est un exemple et entraîne des effets secondaires importants.

• Les inhibiteurs de troisième génération concernent HER1, se lient irréversiblement et covalemment à la cystéine 797, ont des effets secondaires quasi inexistants et comprennent l’osimertinib.

• Les inhibiteurs de la tyrosine kinase provoquent successivement la déphosphorylation de l’EGFR, l’extinction de la voie MAPK, l’extinction de la phosphorylation d’ERK, la levée de l’inhibition d’ERK sur BIM, la libération de BIM et la mort de la cellule cancéreuse.

• Dans l’étude IPASS, la chimiothérapie produisait peu de différences de survie entre les patients avec ou sans mutation de l’EGFR, tandis que le géfitinib améliorait davantage la survie chez les patients porteurs de la mutation et était délétère chez ceux qui en étaient dépourvus.

• L’analyse moléculaire du gène EGFR est nécessaire pour rechercher la mutation avant de choisir le géfitinib, dont l’efficacité est significativement supérieure à celle de la chimiothérapie chez les patients EGFR muté.

• Une baisse du taux d’ADN circulant indique que l’osimertinib est efficace, tandis qu’une hausse indique qu’il est devenu inefficace et justifie un séquençage de l’ADN tumoral circulant pour rechercher une mutation.

• La résistance tumorale à l’osimertinib peut apparaître par mutation de la cystéine 797 en sérine, ce qui entraîne la perte de l’effet de l’osimertinib et conduit à changer de traitement.

Compléments

• Les traitements peuvent cibler chaque étape de l’activation du récepteur ainsi que tous les niveaux des voies de transduction.

• Dans l’étude clinique IPASS, le protocole consistait à administrer un comprimé de géfitinib à 250 mg par jour en monothérapie et en première ligne.

• Chez une personne ayant une tumeur, 3 à 4 % de l’ADN tumoral génomique est présent dans la circulation sanguine sous forme d’ADN circulant.

💡 Astuce mémo

1re génération réversible, 2e et 3e générations irréversibles

📊 Tableaux de synthèse

Types de coenzymes

Étapes du mécanisme d’amidation