Fiche de révision : Méthodes cellulaires et virologie

📋 Plan du Cours

1. Origine et théories du vivant
2. Découverte et théorie cellulaire
3. Cellule et propriétés du vivant
4. Constituants chimiques cellulaires
5. Cellules procaryotes et bactéries
6. Diversité des archées
7. Origine et organites eucaryotes
8. Principes de microscopie
9. Microscopes et modes d’observation
10. Préparation des échantillons
11. Préparation et observation des échantillons
12. Microscopie électronique et validation
13. Méthodes cytochimiques
14. Homogénéisation et fractionnement cellulaire
15. Chromatographie et électrophorèse
16. Culture cellulaire et méthodes expérimentales
17. Découverte et définition des virus
18. Structure et classification virales

📅 Repères chronologiques

1. 1674Antony Van Leeuwenhoek décrit plusieurs micro-organismes vivants, notamment des protistes et des bactéries, grâce à ses améliorations du microscope.
2. 1838Matthias Schleiden conclut que les plantes qu’il observe sont constituées de cellules.
3. 1839Théodore Schwann conclut que les animaux sont constitués de cellules à partir de l’observation de nombreux organismes animaux.
4. 1858Rudolf Virchow affirme que toute cellule provient d’une cellule préexistante, selon le principe « omnis cellula ex cellula », opposé à la génération spontanée.
5. Entre 1887 et 1892Dimitri Ivanovski étudia la mosaïque du tabac et montra que la sève des plants malades contenait un agent infectieux.
6. Entre 1900 et 1902Le virus de la fièvre jaune fut identifié comme le premier virus pathogène de l’Homme.
7. 1957André Lwoff proposa une définition claire et moderne des virus.

📖 1. Origine et théories du vivant

🔑 Notions clés & Définitions

• Génération spontanée : Théorie ancienne selon laquelle certains êtres vivants, particulièrement les insectes, apparaissent à partir de substances inorganiques sous l’effet de facteurs physico-chimiques.

★ À maîtriser

• La théorie du monde à ARN primitif propose que l’ARN ait constitué le point de départ du vivant et acquis des propriétés enzymatiques encore observées chez les ribozymes.

• Selon le scénario du monde à ARN, l’ARN aurait porté l’information génétique, puis l’apparition du ribosome et des protéines aurait précédé l’apparition de l’ADN, favorisée notamment par sa plus grande stabilité.

• LUCA, sigle de Last Universal Common Ancestor, désigne la première cellule fondatrice apparue il y a 3 à 4 milliards d’années, à l’origine des eubactéries, des archæbactéries et des eucaryotes.

Compléments

• L’encapsulation de l’ARN, de l’ADN et des protéines dans une bicouche lipidique serait à l’origine de la cellule primitive.

📌 La panspermie suppose que la vie est apparue dans l’espace avant d’être disséminée sur Terre ; une variante propose une origine martienne, avec transfert de matériel vers la Terre par des impacts de comètes et d’astéroïdes.

💡 Astuce mémo

ARN → ribosome et protéines → ADN → cellule encapsulée

📖 2. Découverte et théorie cellulaire

📝 Points essentiels

• Au XVIIe siècle, Robert Hooke observe des coupes de liège au microscope et propose le terme « cellula », signifiant « petite pièce », pour désigner les compartiments observés.

📌 La théorie cellulaire affirme que tous les êtres vivants, même les plus complexes, sont constitués de cellules et des produits de ces cellules.

📖 3. Cellule et propriétés du vivant

🔑 Notions clés & Définitions

• Biologie cellulaire : Discipline qui étudie la structure et le fonctionnement des cellules ainsi que les mécanismes permettant leur survie.
• Cellule : Unité de base structurale et fonctionnelle de tout être vivant, capable de vivre isolée et de se reproduire.

★ À maîtriser

📌 Le cytoplasme comprend le protoplasme, qui désigne les organites cellulaires, et l’hyaloplasme, le milieu dans lequel baignent ces organites.

📌 Dans les tissus conjonctifs, les cellules sont séparées par une matrice extracellulaire, contrairement aux épithéliums où elles sont jointives.

Compléments

• La taille des cellules s’étend d’environ 1 à 2 micromètres jusqu’à 1 mètre, et leur forme peut être sphérique sans support ou déterminée par le support.

• Les tissus conjonctifs assurent des rôles mécaniques, de soutien et de cohésion, ainsi que des fonctions de nutrition, d’échange et de défense.

📖 4. Constituants chimiques cellulaires

★ À maîtriser

• Les principaux éléments chimiques des cellules sont le carbone, l’hydrogène, l’oxygène et l’azote ; le phosphore et le soufre sont moins abondants, et une vingtaine d’autres éléments sont présents à l’état de traces.

• L’eau représente 60 à 90 % de la matière vivante et assure plusieurs fonctions :

  • solvant
  • milieu de dispersion
  • régulateur thermique
  • fourniture de liaisons hydrogène

• Les protéines comprennent notamment :

  • les protéines de structure
  • les enzymes
  • les régulateurs ou hormones

📌 La structure primaire d’une protéine est l’enchaînement linéaire des acides aminés ; la structure secondaire forme des hélices α ou des feuillets β, la structure tertiaire correspond au repliement de la chaîne et la structure quaternaire à l’association de plusieurs chaînes polypeptidiques.

Compléments

• Les sels minéraux dissous se dissocient en ions positifs ou négatifs, participant à l’équilibre ionique indispensable à la vie cellulaire ; ils contribuent aussi à la structure, comme le phosphate de calcium du squelette, et à la sécrétion.

📌 Les peptides comprennent quelques acides aminés, les polypeptides en comprennent moins de 150 et les protéines plus de 150 ; ces molécules sont des polymères d’acides aminés liés par des liaisons peptidiques.

📖 5. Cellules procaryotes et bactéries

🔑 Notions clés & Définitions

• Plasmide : Fragment circulaire d’ADN à double brin, extrachromosomique et cytoplasmique, présent en une ou plusieurs copies et pouvant coder des enzymes permettant l’utilisation de certains substrats ou la résistance aux antibiotiques.

★ À maîtriser

📌 Les procaryotes sont dépourvus de véritable noyau, car leur matériel génétique n’est pas enfermé dans une enveloppe nucléaire, tandis que les eucaryotes possèdent un noyau délimité par une enveloppe.

• Le chromosome bactérien est une molécule d’ADN bicaténaire circulaire, libre dans le cytoplasme et longue d’environ 1 mm.

• La paroi bactérienne, épaisse de 20 à 80 nm, délimite la bactérie, détermine sa forme et la protège ; elle est séparée de la membrane plasmique par l’espace périplasmique, et une bactérie sans paroi meurt.

Compléments

• Les procaryotes sont unicellulaires et ne forment pas d’organismes pluricellulaires, mais plusieurs cellules peuvent s’associer en colonies.

• La membrane plasmique bactérienne est composée de lipides et de protéines, ne contient pas de cholestérol, est pauvre en glucides et assure le transport des substances nutritives.

💡 Astuce mémo

Procaryote : ADN libre ; eucaryote : ADN dans un noyau

📖 6. Diversité des archées

★ À maîtriser

📌 Les archées sont des procaryotes sans peptidoglycane dans leur paroi ; elles peuvent contenir des pseudopeptidoglycanes, des pseudomuréines, des polysaccharides, des glycoprotéines ou d’autres protéines, et certaines possèdent des complexes protéiques de type histone associés à l’ADN.

• Certaines archées vivent dans des conditions extrêmes, notamment en produisant du méthane ou dans des milieux très acides, très salés ou à des températures supérieures à 70 °C.

• Les archées thermophiles extrêmes prospèrent dans les milieux chauds ; les conditions optimales de la plupart dépassent 80 °C, et les organismes capables de vivre au-dessus de 90 °C sont appelés hyperthermophiles.

Compléments

• Les archées peuvent se multiplier par :

  • scissiparité
  • bourgeonnement
  • fragmentation
  • d’autres mécanismes

• Sulfolobus habite les sources sulfureuses chaudes de Yellowstone et tire son énergie de l’oxydation du soufre ; Pyrolobus présente un optimum de croissance de 106 °C.

• Les archées méthanogènes sont des anaérobies stricts présents notamment dans les sols inondés, les rizières, les sédiments lacustres et marins, les marécages et le tube digestif des animaux ; elles servent au traitement des eaux usées et certaines participent à la digestion de la cellulose chez les herbivores.

📖 7. Origine et organites eucaryotes

★ À maîtriser

• Le premier ancêtre commun des eucaryotes aurait vécu il y a 1,5 à 2 milliards d’années.

• Selon la théorie endosymbiotique, des invaginations de la membrane d’un procaryote ancestral auraient formé le réticulum endoplasmique et l’enveloppe nucléaire, puis l’intégration d’un procaryote aérobie hétérotrophe aurait donné naissance aux mitochondries et celle d’une cyanobactérie aurait donné naissance aux chloroplastes.

• Les cellules eucaryotes possèdent un noyau entouré d’une enveloppe nucléaire et un cytoplasme organisé contenant un système endomembranaire et des organites.

📌 Le réticulum endoplasmique lisse synthétise des lipides et participe à la détoxification, tandis que le réticulum endoplasmique rugueux porte des ribosomes et participe à la synthèse des protéines membranaires et exportées ainsi qu’au contrôle de leur qualité.

Compléments

📌 Les endosomes acheminent vers les lysosomes les substances provenant de l’espace extracellulaire par endocytose, tandis que les lysosomes digèrent des molécules intracellulaires ou endocytées grâce à des enzymes actives en milieu acide.

• L’appareil de Golgi est formé de citernes aplaties et parallèles, les saccules, associées à des vésicules ; il assure notamment la maturation des protéines, leur glycosylation ou leur sulfation et des coupures protéolytiques.

💡 Astuce mémo

Invaginations → noyau et réticulum ; endosymbioses → mitochondries et chloroplastes

📖 8. Principes de microscopie

★ À maîtriser

📐 Formule - La limite de résolution du microscope est donnée par la formule d’Abbe $\varepsilon = \frac{0{,}61\lambda}{n\sin u}$, où λ est la longueur d’onde, n l’indice de réfraction et u la moitié de l’angle d’ouverture du cône lumineux.

• Le pouvoir séparateur correspond à la distance minimale appréciable entre deux points ; cette distance est de 100 à 200 µm pour l’œil humain et de 0,2 µm pour un microscope photonique à transmission.

📌 En microscopie par transmission, les photons ou les électrons traversent l’échantillon et renseignent sur sa structure interne, tandis qu’en microscopie par réflexion seuls les rayons réfléchis par la surface sont captés.

Compléments

• En microscopie par transmission, l’échantillon doit être mince et présenter des différences d’absorption ou de contraste ; les coupes en microscopie optique sont indiquées entre 2 et 10 µm et celles en microscopie électronique entre 0,03 et 0,05 µm.

💡 Astuce mémo

Transmission : intérieur ; réflexion : surface

📖 9. Microscopes et modes d’observation

★ À maîtriser

📌 Le microscope photonique utilise des photons et permet des grossissements d’environ ×1 000, tandis que le microscope électronique utilise des électrons, permet d’observer l’ultrastructure et atteint des grossissements pouvant aller jusqu’à ×500 000.

📌 Le microscope électronique à transmission forme l’image à partir des électrons qui traversent un échantillon très mince, tandis que le microscope électronique à balayage utilise les électrons réémis par la surface d’échantillons massifs pour en montrer l’aspect tridimensionnel.

Compléments

• Le microscope à contraste de phase amplifie les différences d’indices de réfraction pour observer des cellules vivantes et suivre leurs mouvements, notamment la mitose.

• En microscopie à fluorescence, un premier filtre laisse passer la lumière qui excite le fluorochrome et un second filtre ne laisse passer que la lumière émise par celui-ci ; la fluorescéine et la rhodamine sont des exemples de fluorochromes.

• En 1931, Max Knoll et Ernst Ruska construisent le premier microscope électronique ; Ernst Ruska reçoit le prix Nobel de physique en 1986 pour cette invention.

📖 10. Préparation des échantillons

★ À maîtriser

• 🔄 Le traitement suit cet ordre :
  1. Fixation pour consolider les structures.
  2. Inclusion pour durcir l’échantillon.
  3. Microtomie pour obtenir des coupes.
  4. Coloration pour créer du contraste.

Compléments

• La fixation est un traitement chimique ou physique appliqué aux cellules avant d’autres manipulations afin de préserver au mieux leurs structures, et elle entraîne généralement leur mort.

• Pour durcir un échantillon par inclusion, l’eau des cellules fixées est remplacée successivement par de l’éthanol puis du toluène, avant l’infiltration de paraffine chaude qui se solidifie en refroidissant.

• Les coupes obtenues après inclusion à la paraffine mesurent 2 à 5 µm, tandis que les coupes après congélation mesurent 5 à 10 µm.

💡 Astuce mémo

Fixer → inclure → couper → colorer

📖 11. Préparation et observation des échantillons

🔑 Notions clés & Définitions

• Fixation : Traitement chimique ou physique de cellules vivantes qui permet des manipulations ultérieures en limitant les dommages aux structures cellulaires et entraîne généralement la mort des cellules.

★ À maîtriser

• 🔄 La préparation classique suit ces étapes :

  1. Fixation pour consolider
  2. Inclusion pour durcir
  3. Microtomie pour couper
  4. Coloration pour contraster

• Pour inclure des cellules en paraffine, on remplace d’abord l’eau des cellules fixées par de l’éthanol, puis par du toluène, avant d’ajouter la paraffine chaude qui se solidifie au refroidissement.

• Les coupes obtenues après inclusion en paraffine mesurent 2 à 5 µm, contre 5 à 10 µm au mieux après congélation.

Compléments

• Pour couper des échantillons congelés, le microtome est équipé d’une enceinte maintenue à −20 °C.

💡 Astuce mémo

Fixer, durcir, couper, contraster

📖 12. Microscopie électronique et validation

★ À maîtriser

• En microscopie électronique, le vide poussé est de l’ordre de $10^{-5}$ mm de mercure et impose l’observation de substances non volatiles sous cette pression.

• En microscopie électronique par transmission, l’épaisseur des échantillons ne doit pas dépasser un dixième de micromètre pour exploiter le pouvoir séparateur de l’appareil.

• 🔄 La préparation suit ces étapes :

  1. Fixation
  2. Déshydratation
  3. Durcissement
  4. Réalisation des coupes
  5. Obtention des contrastes

📌 L’ombrage dépose des vapeurs métalliques sous incidence rasante pour créer une ombre autour des objets, tandis que la coloration négative dépose de l’acide phosphotungstique opaque aux électrons autour des objets, qui apparaissent clairs sur fond sombre.

• En microscopie électronique à balayage, les spécimens biologiques très hydratés sont congelés puis déshydratés par sublimation de la glace sous vide, avant le dépôt d’une mince couche d’or ou de platine qui rend leur surface conductrice.

• 🔄 Le cryodécapage suit ces étapes :

  1. Congeler rapidement l’échantillon
  2. Le fracturer sous vide à basse température
  3. Sublimer la glace pour décaper la surface
  4. Déposer du platine par ombrage
  5. Renforcer le dépôt par vaporisation de carbone
  6. Dissoudre les débris cellulaires
  7. Recueillir la réplique sur une grille de cuivre et l’observer

Compléments

• En microscopie électronique par transmission, les objets de petite taille peuvent être déposés sur une membrane transparente aux électrons d’environ 100 à 200 angströms, soutenue par une grille de cuivre de 3 mm de diamètre.

• La diffraction des rayons X aux petits angles permet d’étudier des échantillons relativement épais et des groupes importants de cellules grâce au pouvoir de pénétration des rayons X.

💡 Astuce mémo

Transmission traverse l’objet ; balayage révèle sa surface

📖 13. Méthodes cytochimiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Colorant : Molécule qui absorbe certaines longueurs d’onde de la lumière et confère une couleur au composant auquel elle se lie.

★ À maîtriser

📌 Les colorants vitaux ne tuent pas la cellule ou ne la tuent pas immédiatement, mais peuvent être toxiques et provoquer des artéfacts, tandis que les colorants incompatibles avec la vie exigent une fixation préalable et donnent de meilleurs contrastes.

• La réaction APS localise les polysaccharides en oxydant leurs fonctions hydroxyle par l’acide périodique pour former des aldéhydes, puis en révélant ces fonctions avec le réactif de Schiff, qui colore en rouge les régions riches en polysaccharides.

📌 Dans le test de Brachet, le vert de méthyle colore l’ADN en vert et la pyronine colore l’ARN en rouge, tandis que les traitements par DNase ou RNase servent à vérifier la spécificité de la coloration.

• La localisation d’un antigène par anticorps consiste à former d’abord un complexe antigène-anticorps sur la coupe, puis à révéler ce complexe avec un anticorps marqué.

Compléments

• Pour identifier un polysaccharide par la réaction APS, on peut digérer au préalable la coupe avec une enzyme donnée, puis comparer la coloration obtenue à celle d’une coupe non digérée.

• Les anticorps révélateurs peuvent être marqués par :

  • Des enzymes, détectées en microscopie photonique par transmission
  • Des fluorochromes, détectés au microscope à fluorescence
  • Des radioisotopes, détectés par autoradiographie

📖 14. Homogénéisation et fractionnement cellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Homogénat cellulaire : Broyat constitué d’organites en suspension, de débris cellulaires et de constituants biochimiques en solution.
• Centrifugation : Opération qui soumet un mélange à une force centrifuge produite par la rotation d’un rotor afin de séparer ses constituants selon leur vitesse de sédimentation, liée notamment à leur taille et à leur densité.

★ À maîtriser

• Lors d’un choc osmotique, des cellules placées en milieu hypotonique absorbent de l’eau, gonflent puis éclatent lorsque leur membrane plasmique ne résiste plus à l’augmentation de volume.

• La centrifugation d’un homogénat produit un culot contenant les constituants sédimentés et un surnageant contenant ceux qui ne l’ont pas été.

• L’ultracentrifugation différentielle sépare les organites par des centrifugations successives à accélérations croissantes, les organites les plus rapides à sédimenter formant des culots au cours des premières étapes.

Compléments

• Les tissus destinés au broyage au mortier avec abrasif sont souvent congelés immédiatement dans l’azote liquide à −196 °C ou la carboglace à −80 °C.

📌 Pour lyser des cellules possédant une paroi par choc osmotique, il faut digérer préalablement cette paroi avec des enzymes dans une solution isotonique tamponnée.

• La centrifugation sur gradient de densité sépare les particules en bandes selon leur sédimentation dans un gradient de substance dense non ionique, comme le saccharose ou le glycérol.

💡 Astuce mémo

Différences de sédimentation → séparation des organites

📖 15. Chromatographie et électrophorèse

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie : Méthode qui sépare les constituants d’un mélange dissous par leur migration entre une phase mobile et une phase stationnaire, selon des critères tels que la solubilité, l’adsorption, la charge électrique ou l’affinité chimique.
• Électrophorèse : Méthode d’analyse qualitative et quantitative qui sépare des particules chargées selon leur migration différentielle sous l’influence d’un champ électrique.

★ À maîtriser

• En chromatographie sur papier, l’éluant monte par capillarité, entraîne l’échantillon et sépare ses substances selon leurs interactions avec le papier ; le chromatogramme peut ensuite être révélé directement, sous ultraviolet ou avec un réactif comme l’iode.

• En chromatographie d’adsorption, les solutés se répartissent entre un adsorbant solide fixe qui les retient et une phase mobile qui les entraîne, ce qui produit une migration différentielle et leur séparation.

• L’électrophorèse sur gel d’agarose permet de séparer et d’identifier des fragments d’ADN, d’estimer leur taille et leur quantité, ou de purifier un fragment de taille connue.

📌 En PAGE non dénaturante, les protéines migrent vers l’anode selon leur rapport charge/masse, tandis qu’en SDS-PAGE le SDS leur confère une charge négative comparable et permet leur séparation selon leur masse moléculaire.

• En électrophorèse bidimensionnelle, les protéines sont d’abord séparées selon leur charge par focalisation isoélectrique dans un gradient de pH, puis selon leur taille par SDS-PAGE dans une direction perpendiculaire.

Compléments

• En chromatographie sur couche mince, la phase stationnaire est généralement une fine couche de silice déposée sur un support, et l’échantillon est appliqué près du bord de la plaque.

• L’électrophorèse sur papier, peu résolutive, sert surtout à séparer de petites molécules comme les acides aminés, qui peuvent être révélés par une réaction colorimétrique à la ninhydrine.

💡 Astuce mémo

Chromatographie : affinités ; électrophorèse : charge électrique

📖 16. Culture cellulaire et méthodes expérimentales

🔑 Notions clés & Définitions

• Culture cellulaire : Technique de laboratoire qui maintient des cellules en vie in vitro dans des conditions contrôlées afin de modifier leurs propriétés ou d’augmenter leur nombre.

★ À maîtriser

• La culture cellulaire nécessite :
  • Un espace stérile de manipulation
  • Un incubateur
  • Un milieu adapté au type de cellule et à l’objectif de l’expérience

Compléments

• Les cellules congelées peuvent être stockées dans un congélateur à −80 °C ou dans un congélateur à azote liquide.

📖 17. Découverte et définition des virus

🔑 Notions clés & Définitions

• Virus : Agent infectieux qui se multiplie obligatoirement à l’intérieur d’une cellule hôte, dont il détourne le métabolisme pour produire ses constituants.

★ À maîtriser

• En 1935, Wendell Stanley cristallisa le virus de la mosaïque du tabac sous forme de cristal protéique ; des études complémentaires menées l’année suivante montrèrent que le cristal contenait également de l’ARN.

📌 Le virion ne possède qu’un seul type d’acide nucléique, ne se divise pas, ne code pas les enzymes du métabolisme intermédiaire producteur d’énergie et utilise les structures de la cellule hôte, notamment ses ribosomes, pour se multiplier. - Lwoff

Compléments

• Le virus de la fièvre aphteuse est présenté comme le premier virus identifié, par Friedrich Loeffler et Paul Frosch.

💡 Astuce mémo

Ivanovski observe, Stanley cristallise, Lwoff définit

📖 18. Structure et classification virales

🔑 Notions clés & Définitions

• Capside : Coque constituée de sous-unités protéiques appelées protomères qui entoure et protège l’acide nucléique viral.

★ À maîtriser

• Un virus est constitué d’un génome d’ADN ou d’ARN, à un ou deux brins, entouré d’une capside protéique ; certains virus possèdent en plus une enveloppe issue de la membrane de la cellule infectée.

• La taille des virus se situe entre 10 et 400 nm, et leurs génomes contiennent de quelques gènes à 1 200 gènes.

• 🔄 La classification considère successivement (Lwoff, 1962) :

  1. Le génome
  2. La présence ou l’absence d’enveloppe
  3. La symétrie de la capside

• 🔄 La multiplication virale comprend six étapes :

  1. Attachement à la cellule hôte
  2. Pénétration
  3. Décapsidation
  4. Réplication des composants viraux
  5. Assemblage ou encapsidation
  6. Libération des nouveaux virus

• Le VIH cible des lymphocytes T et possède un génome constitué d’ARN monocaténaire ainsi qu’une transcriptase inverse.

• Dans le cycle du VIH, la transcriptase inverse synthétise un ADN à partir de l’ARN viral, puis un second brin complémentaire forme un ADN bicaténaire qui s’intègre au génome de la cellule hôte.

• Après intégration du génome du VIH, les gènes proviraux sont transcrits, les protéines virales sont synthétisées, les capsides se forment et de nouveaux virus quittent la cellule.

Compléments

• Le virus delta est présenté comme le plus petit virus connu, avec un seul gène, tandis que le mimivirus est présenté comme le plus gros, avec un diamètre de 400 nm et 1 200 gènes.

• L’ensemble formé par la capside et le génome viral est appelé nucléocapside, et la structure de la capside distingue notamment les symétries cubique et hélicoïdale.

📌 Un provirus est un génome viral intégré à l’ADN de la cellule hôte après rétrotranscription de l’ARN viral en ADN, tandis qu’un viroïde est un ARN circulaire sans capside qui ne code aucune protéine.

• La classification virale distingue des virus à ADN ou à ARN, des acides nucléiques monocaténaires ou bicaténaires, et des génomes linéaires ou circulaires, segmentés ou non segmentés.

💡 Astuce mémo

G-E-S : génome, enveloppe, symétrie

📊 Tableaux de synthèse

Microscopie par transmission et réflexion