Fiche de révision : Méthodes d’étude en biologie cellulaire

📋 Plan du Cours

1. Caractéristiques des lignées cellulaires
2. Conditions de culture cellulaire
3. Établissement et conservation des lignées
4. Utilisations des lignées cellulaires
5. Cytométrie et immunomarquage
6. Dosage ELISA des protéines
7. Fractionnement cellulaire
8. Western blot et expérimentation animale

📖 1. Caractéristiques des lignées cellulaires

★ À maîtriser

📌 Une lignée cellulaire a une durée de vie limitée lorsqu’elle dégénère après un nombre déterminé de passages, mais elle peut vivre plus longtemps qu’une cellule primaire, notamment lorsqu’il s’agit de cellules souches ou non différenciées.

• Les cellules immortelles comprennent: les cellules cancéreuses, les cellules rendues immortelles par un virus comme SV40, les cellules génétiquement modifiées

📌 Les cellules circulantes sont non adhérentes, comme les lymphocytes et les macrophages, tandis que les cellules d’organes sont généralement adhérentes.

Compléments

• Les principales morphologies cellulaires sont:
  • épithéliales : adhérentes, plates et polygonales
  • lymphoblastiques : sphériques et non adhérentes
  • fibroblastiques : adhérentes, allongées et bipolaires

💡 Astuce mémo

Lignée limitée : passages finis ; lignée immortelle : prolifération illimitée

📖 2. Conditions de culture cellulaire

★ À maîtriser

📌 L’environnement de culture doit se rapprocher des conditions physiologiques in vivo grâce à des contenants stériles et à un milieu adapté en nutriments, facteurs de croissance, température, pH, oxygène, osmolarité et humidité.

• Le milieu de culture minimum contient: de l’eau, une source de carbone et d’énergie comme le glucose, du sérum contenant des facteurs de croissance et des hormones, une source d’azote, des sels minéraux, des sources d’oligo-éléments, un pH constant

Compléments

• Le milieu empirique contient notamment:
  • des extraits de viande ou de levures
  • des peptones
  • des liquides biologiques
  • des facteurs de croissance et d’adhésion
  • des hormones spécifiques

📌 Le choix du milieu dépend des besoins cellulaires, notamment de la localisation anatomique et de l’état de différenciation, tandis que le choix du contenant dépend du nombre de cellules disponibles.

📖 3. Établissement et conservation des lignées

★ À maîtriser

• L’établissement d’une lignée à partir d’une biopsie consiste à fragmenter le tissu par un cocktail enzymatique, cultiver la suspension cellulaire dans un milieu enrichi, laisser proliférer les populations puis sélectionner un clone d’intérêt.

• À partir d’un prélèvement sanguin, le Ficoll et la centrifugation séparent les constituants selon leur densité, puis les populations cellulaires sont isolées par anticorps couplés à des billes magnétiques ou par cytométrie en flux.

• La congélation d’une lignée comprend le comptage des cellules, la congélation rapide d’environ un million de cellules par ampoule avec 10 % de DMSO, puis la conservation à -195 °C dans l’azote liquide ou à -150 °C dans un congélateur.

Compléments

• La décongélation est rapide à 37 °C, suivie d’un lavage pour éliminer le DMSO, puis d’un test de viabilité comme le bleu de trypan, qui ne colore pas les cellules vivantes mais pénètre dans les cellules mortes.

💡 Astuce mémo

Prélever, sélectionner, compter, congeler, décongeler

📖 4. Utilisations des lignées cellulaires

★ À maîtriser

• Les principales utilisations des lignées cellulaires concernent: l’étude du cycle cellulaire, du métabolisme et de la régulation génique, les greffes et autogreffes, le dépistage de maladies génétiques, la thérapie génique

• La cytotoxicité d’une molécule peut être évaluée par sa concentration inhibitrice à 50 %, appelée CI50.

Compléments

• Un test de migration cellulaire dépose les cellules sur une membrane poreuse, ajoute une molécule destinée à ralentir leur migration, puis utilise le colorant Giemsa pour mesurer la migration le lendemain.

📖 5. Cytométrie et immunomarquage

★ À maîtriser

• En cytométrie, les cellules passent une à une devant un laser, chaque événement correspondant à une cellule, afin de reconnaître des marqueurs fluorescents, trier les cellules selon leur morphologie ou déterminer leur phase du cycle cellulaire.

📌 L’immunohistochimie utilise un anticorps couplé à une enzyme observé en microscopie optique à lumière directe, tandis que l’immunofluorescence utilise un anticorps couplé à un fluorophore observé en microscopie à fluorescence.

Compléments

📌 Une molécule cytostatique bloque la cellule dans une phase donnée du cycle cellulaire.

💡 Astuce mémo

Immunohistochimie : enzyme et lumière directe ; immunofluorescence : fluorophore et fluorescence

📖 6. Dosage ELISA des protéines

★ À maîtriser

📌 L’ELISA indirect dose un anticorps, tandis que l’ELISA sandwich dose un antigène.

• En ELISA, un anticorps secondaire couplé à une molécule réagissant avec un substrat produit une coloration dont l’intensité est proportionnelle à la concentration de la protéine cible.

Compléments

📌 La quantification ELISA nécessite une gamme étalon composée de puits contenant des concentrations connues de l’échantillon, puis une mesure de la densité optique au spectrophotomètre à une longueur d’onde donnée.

💡 Astuce mémo

ELISA indirect : anticorps ; ELISA sandwich : antigène

📖 7. Fractionnement cellulaire

★ À maîtriser

📌 La centrifugation sépare les constituants selon leur taille et leur densité : les éléments grands ou denses sédimentent rapidement dans le culot, tandis que les éléments petits ou peu denses nécessitent une vitesse et une durée plus élevées.

• Les constituants sédimentent aux vitesses suivantes:

  • 1000 G : cellules, noyaux et cytosquelette
  • 20 000 G : mitochondries, lysosomes et peroxysomes
  • 80 000 G : microsomes et petites vésicules
  • 150 000 G : macromolécules, virus et ribosomes

• Les chromatographies sur colonne reposent sur:

  • la taille : filtration sur gel
  • la charge : échange d’ions
  • l’affinité : chromatographie d’affinité

Compléments

📌 Les tubes placés en face à face dans une centrifugeuse doivent avoir le même poids afin d’éviter d’endommager ou de casser le rotor.

💡 Astuce mémo

1000 G : noyaux ; 20 000 G : mitochondries ; 80 000 G : microsomes ; 150 000 G : ribosomes

📖 8. Western blot et expérimentation animale

★ À maîtriser

• Le Western blot consiste à libérer les protéines avec un détergent, les séparer par électrophorèse sur gel d’acrylamide, les transférer sur une membrane de nitrocellulose ou de PVDF, puis les révéler avec des anticorps et par chimiluminescence.

📌 Lors du transfert en Western blot, les protéines migrent toujours du pôle négatif vers le pôle positif, et les quantités déposées dans les puits doivent être équivalentes pour interpréter les bandes.

📌 L’expérimentation animale nécessite un accord du ministère, une habilitation et l’examen par des comités d’éthique avant d’être utilisée pour tester des molécules ou comprendre des pathologies.

Compléments

📌 Les techniques analogues au Western blot détectent l’ADN par Southern blot et l’ARN par Northern blot.

• Chez la souris transgénique, la greffe de cellules cultivées, éventuellement modifiées pour exprimer ou supprimer un gène, peut induire ou réduire une pathologie et permettre d’étudier la progression d’une tumeur ou l’effet d’une cible thérapeutique.

💡 Astuce mémo

Extraire, séparer, transférer, révéler

📊 Tableaux de synthèse

Types de milieux de culture