Fiche de révision : Méthodes d’observation et d’immunodétection

📋 Plan du Cours

1. Fluorescence et microscopies
2. Cytométrie de flux
3. Détection immuno-enzymatique
4. Analyse et purification des protéines

📖 1. Fluorescence et microscopies

★ À maîtriser

• La fluorescence repose sur une excitation et une émission à deux pics spectraux différents.

• Le microscope confocal utilise un laser et observe un point focal, puis permet de reconstituer une image en trois dimensions à partir de coupes.

• La microscopie électronique utilise des électrons comme source d’excitation et donne accès à l’ultrastructure.

📌 Le MET permet d’observer l’ultrastructure, tandis que le MEB permet d’observer la surface et sa granulosité.

Compléments

• La chromatine correspond à la compaction de l’ADN.

• Le gain amplifie le signal d’entrée et augmente la luminosité de l’image.

• L’offset permet d’enlever le bruit de fond de l’image.

• Le DAPI est excité dans l’ultraviolet et émet une fluorescence bleue.

💡 Astuce mémo

Le MET révèle l’ultrastructure interne, tandis que le MEB montre la surface.

📖 2. Cytométrie de flux

🔑 Notions clés & Définitions

• Cytométrie de flux : Consiste à faire passer des cellules ou des particules en suspension, une par une, dans un faisceau laser.

★ À maîtriser

• La lumière diffusée vers l’avant par les cellules en cytométrie de flux renseigne sur leur taille.

Compléments

• En cytométrie de flux, les cellules marquées par un fluorochrome sont distinguées des cellules non marquées.

• Dans le diagramme de cytométrie de flux, le nombre total correspond au premier pic.

💡 Astuce mémo

Cellules en suspension → passage une par une → faisceau laser.

📖 3. Détection immuno-enzymatique

🔑 Notions clés & Définitions

• Épitope : L’épitope, ou déterminant antigénique, est la partie de l’antigène reconnue par un anticorps ou un récepteur lymphocytaire.
• ELISA : L’ELISA est une technique immuno-enzymatique sur support solide utilisée pour détecter un antigène ou un anticorps dans un échantillon biologique.

★ À maîtriser

📌 Un anticorps monoclonal est spécifique d’un épitope donné, tandis qu’un anticorps polyclonal reconnaît plusieurs épitopes d’un même antigène.

Compléments

• Un chromogène est un produit coloré utilisé dans une détection immuno-enzymatique.

📖 4. Analyse et purification des protéines

🔑 Notions clés & Définitions

• Western blot : Le Western blot sépare des protéines par électrophorèse dans un gel, puis les transfère sur une membrane, souvent en nitrocellulose, pour les révéler.

★ À maîtriser

📌 L’immunoprécipitation isole une protéine spécifique, tandis que la co-immunoprécipitation isole une protéine et ses partenaires en interaction.

Compléments

• En électrophorèse, les protéines migrent dans un champ électrique du pôle négatif, la cathode, vers le pôle positif, l’anode.

• Le SDS est un détergent qui permet de charger les molécules et de les trier selon leur taille.

• Le DTT et le mercaptoéthanol sont des agents réducteurs qui coupent les ponts disulfure.

• En immunohistochimie, la perméabilisation au moyen d’un détergent doux comme le Triton X-100 crée de petits trous dans les cellules.

• En immunodétection indirecte, un anticorps primaire est reconnu par un anticorps secondaire fixé à une enzyme.

• Les protéines possèdent une terminaison N-terminale NH2 et une terminaison C-terminale COOH.

💡 Astuce mémo

Immunoprécipitation : isoler une protéine ; co-immunoprécipitation : isoler ses partenaires.