Fiche de révision : Organoïdes et cultures tridimensionnelles

📋 Plan du Cours

1. Définition et évolution des organoïdes
2. Formation et usages des sphéroïdes
3. Corps embryoïdes et développement
4. Bio-ingénierie des microtissus
5. Applications et limites des organoïdes
6. Scaffolds et organisation des cultures
7. Co-émergence et assemblage des organoïdes
8. Matrices et conditions de culture
9. Modèles tridimensionnels du muscle
10. Jonction neuromusculaire et maladie de Charcot
11. Organoïdes rétiniens
12. Limites et vascularisation des organoïdes

📖 1. Définition et évolution des organoïdes

🔑 Notions clés & Définitions

• Organoïde : Structure tridimensionnelle où plusieurs types cellulaires sont organisés de façon à imiter un tissu ou une partie de tissu.
• Gastruloïde : Structure 3D conçue pour représenter la gastrulation.

★ À maîtriser

📌 Un sphéroïde peut contenir un seul ou plusieurs types cellulaires, tandis qu’un organoïde, dans la définition générale, comporte plusieurs types cellulaires organisés en 3D.

📌 La culture 2D permet d’observer l’organisation cellulaire sur une surface plane, mais ne reproduit pas les contraintes mécaniques d’un organe organisé en 3D.

Compléments

• Les organoïdes permettent d’étudier l’organisation d’un tissu hors de l’animal, avec au moins une fonction identique à celle de l’organe visé.

• Les résultats d’essais de drogues sur cellules en 2D peuvent différer de ceux obtenus sur modèle animal, où la drogue peut se révéler moins efficace.

• Au début du 20e siècle, Wilson dissociait complètement une éponge puis observait la réorganisation des cellules et la régénération d’un organisme entier.

• Dans les années 70, des mini-tissus épidermiques ont été reproduits in vitro à partir de kératinocytes et de fibroblastes.

• Le suffixe « oïde » désigne une structure en 3D ; les noms employés comprennent sphéroïdes, gastruloïdes, embryoïdes et cérébroïdes.

• L’ajout de différents types cellulaires rend un modèle 3D plus complexe ; des épidermes reconstitués in vitro ont été greffés sur des souris, où l’épiderme a été réparé.

💡 Astuce mémo

Le sphéroïde agrège des cellules ; l’organoïde organise plusieurs types cellulaires

📖 2. Formation et usages des sphéroïdes

🔑 Notions clés & Définitions

• Sphéroïde : Modèle 3D le plus simple, formé par l’agrégation de cellules.

★ À maîtriser

• Pour former des sphéroïdes, les cellules sont placées dans des boîtes à faible adhérence afin qu’elles adhèrent entre elles plutôt qu’à la boîte de culture.

📌 Un sphéroïde homotypique contient un seul type de cellule, comme des cellules cancéreuses, tandis qu’un sphéroïde hétérotypique associe des cellules cancéreuses et des fibroblastes du derme.

• Dans un sphéroïde, la diffusion limitée de l’oxygène rend le centre hypoxique, tandis que la surface ne l’est pas.

Compléments

• Dans un sphéroïde hétérotypique de cellules cancéreuses et de fibroblastes, deux couches correspondant aux différents types cellulaires peuvent se former.

• Les cellules cancéreuses peuvent proliférer en 2D et former des multicouches ; les cellules métastatiques présentent des adhérences différentes liées à des modifications de la signalisation des intégrines.

• Le gradient d’oxygène d’un sphéroïde reproduit la différence entre le centre hypoxique et la périphérie d’une tumeur.

• Les sphéroïdes tumoraux peuvent servir au screening de drogues afin d’évaluer la réduction de la taille tumorale et l’efficacité d’une drogue sur les cellules situées à l’intérieur de la tumeur.

• Des sphéroïdes peuvent aussi être obtenus à partir de cellules musculaires, même si celles-ci ne sont pas destinées à proliférer et migrer.

💡 Astuce mémo

Un cœur sphéroïdal hypoxique entouré d’une périphérie oxygénée

📖 3. Corps embryoïdes et développement

🔑 Notions clés & Définitions

• Embryoïde : Structure organisée comprenant plusieurs types cellulaires mélangés et spécialisés en multicouches qui imitent le rapprochement de types cellulaires observé dans l’embryon.

★ À maîtriser

• Les corps embryoïdes sont utilisés pour étudier le développement et se forment par auto-assemblage tridimensionnel de cellules souches embryonnaires dans des conditions de culture adaptées.

Compléments

• Les multicouches peuvent représenter :
  • l’endoderme
  • le mésoderme
  • l’ectoderme

📌 Les gastruloïdes et les blastoïdes sont des embryoïdes qui représentent différents stades du développement.

• Les embryoïdes sont le plus souvent formés à partir de cellules souches embryonnaires ou de cellules iPSC.

• La formation de corps embryoïdes peut passer par la culture 2D de cellules iPSC avec des MEFs apportant des cytokines et des nutriments, leur mise en suspension, leur auto-assemblage en 3D et la formation de différentes couches.

• Lors de la différenciation d’un corps embryoïde, le marqueur de pluripotence OCT4 peut laisser place à SOX17, ce qui correspond au passage vers un état plus différencié.

💡 Astuce mémo

Suspension des cellules souches → auto-assemblage → différenciation

📖 4. Bio-ingénierie des microtissus

★ À maîtriser

• Dans une bio-ingénierie de microtissus, les cellules placées dans du collagène se compactent et forment naturellement un microtissu qui se différenciera ensuite.

Compléments

• La matrice dans laquelle sont placées les cellules exerce une traction qui les met sous tension mécanique.

💡 Astuce mémo

Le collagène compacte les cellules → la matrice les met sous tension

📖 5. Applications et limites des organoïdes

★ À maîtriser

• Les lignées iPSC peuvent subir une dérive génétique ; des critères doivent donc vérifier que les cellules conservent leur état initial et une variabilité fixée au cours de l’expérience.

• Les organoïdes bien caractérisés et reproductibles peuvent servir au screening de drogues, à la modélisation de maladies et à la réduction du nombre de modèles animaux utilisés.

📌 Un organoïde ne remplace pas totalement un modèle animal, car il n’est pas complètement différencié comme l’organe qu’il imite et certains tissus sont plus difficiles à reproduire que d’autres.

Compléments

• La culture d’iPSC et d’organoïdes coûte beaucoup plus cher que celle des lignées cellulaires classiques.

• Les organoïdes peuvent modéliser des pathologies génétiques ou servir au screening de drogues.

• Les organoïdes permettent de cribler un grand nombre de drogues, ce qui n’est pas possible sur des animaux.

• Les matrigels, hydrogels couramment utilisés comme scaffolds pour les organoïdes, proviennent d’animaux et maintiennent donc un usage animal dans leur fabrication.

• Les sphéroïdes formés dans différents laboratoires peuvent présenter une forte variabilité, d’où le besoin de sphéroïdes reproductibles et standardisés.

• Pour obtenir une matrice extracellulaire tumorale, des cellules cancéreuses sont injectées dans un animal, une tumeur est laissée se former, puis sa matrice extracellulaire est récupérée.

• La matrice extracellulaire récupérée d’une tumeur n’est pas complètement physiologique pour le tissu d’intérêt.

💡 Astuce mémo

Le screening peut réduire l’usage animal, mais l’organoïde ne remplace pas totalement l’animal

📖 6. Scaffolds et organisation des cultures

🔑 Notions clés & Définitions

• Tissue engineering : Utilisation d’un élément extérieur, le scaffold, pour aider à organiser les cellules en structure 3D.

★ À maîtriser

📌 Le choix de l’hydrogel dépend du type cellulaire utilisé et des propriétés in vivo du tissu, notamment s’il est mou ou rigide.

Compléments

• Les hydrogels peuvent donner une structure aux cellules, sans nécessairement reproduire la structure de l’organe in vivo.

• 🔄 Une approche de construction d’un tissu neuronal consiste à :

  1. Différencier des cellules souches en neurones.
  2. Récupérer les neurones.
  3. Les placer dans un biomatériau.

• Le micropatterning de surfaces permet aux cellules capables de s’auto-assembler de suivre un motif et peut servir à obtenir des tubes qui se forment lors de l’embryogenèse.

• Le bioprinting peut imposer une forme aux cellules afin d’obtenir des couches.

• Les stratégies de culture peuvent faire varier le moment où les cellules adhèrent, la réunion de cellules co-différenciées, l’usage de microchips pour étudier leur communication et l’emploi d’hydrogels ou du bioprinting.

📖 7. Co-émergence et assemblage des organoïdes

🔑 Notions clés & Définitions

• Assembloïde : Structure obtenue en mettant deux organoïdes ensemble, qui fusionnent pour reformer un organoïde plus grand contenant les cellules des deux organoïdes.

📝 Points essentiels

• La co-émergence repose sur le développement simultané de cellules, dont certaines iPSC peuvent spontanément former différents types cellulaires, mais cette approche échoue parfois.

• La bio-ingénierie peut produire des organoïdes par co-émergence, assemblage d’organoïdes ou bioprinting.

💡 Astuce mémo

Co-émergence : plusieurs types émergent ensemble ; assembloïde : deux organoïdes fusionnent.

📖 8. Matrices et conditions de culture

🔑 Notions clés & Définitions

• Feeder : Couche de cellules sur laquelle on cultive des cellules souches embryonnaires afin de leur apporter différentes cytokines et des nutriments.

★ À maîtriser

• Des cytokines piégées dans un hydrogel peuvent être libérées de manière contrôlée dans l’espace et le temps afin de favoriser la différenciation et de mimer des conditions observées in vivo.

• Pour obtenir une matrice extracellulaire décellularisée, on élimine les cellules d’un tissu sain tout en conservant sa matrice, puis on transforme celle-ci en poudre pour l’incorporer à une structure tridimensionnelle.

• Les facteurs de croissance, les cytokines et l’oxygène du milieu influencent la différenciation des cellules et des tissus.

Compléments

• Les hydrogels permettent de former différentes structures, notamment des tubes et des vascularisations, et de régler des conditions mécaniques.

📌 Les hydrogels à base de PEG et de collagène sont des alternatives possibles, mais leur pertinence dépend du type cellulaire, qui peut se différencier dans le collagène et non dans le PAA.

• Les matrices extracellulaires diffèrent selon les tissus, notamment entre le muscle et l’épithélium, tandis que les hydrogels utilisés peuvent contenir du collagène, de la gélatine ou du Matrigel.

• Dans un modèle neuronal, l’acide rétinoïque favorise la différenciation en interneurones, tandis que l’acide rétinoïque associé à BMP4 favorise des neurones proprioceptifs et mécanorécepteurs aux marqueurs et fonctions différents.

• Les cellules humaines et murines, ainsi que des cellules d’un même type provenant de modèles murins différents, peuvent se comporter différemment en culture.

• Les cellules C2C12 forment des sphéroïdes avec du collagène, tandis que les cellules satellites ne forment pas de sphéroïdes dans le collagène et nécessitent du Matrigel, sans obtenir la même forme.

📌 La culture de cellules souches embryonnaires avec ou sans feeder et avec ou sans sérum produit des structures différentes.

• En présence de sérum, SOX17 est davantage exprimé à l’extérieur de la structure et OCT4 vers l’intérieur, tandis que l’absence de sérum réduit cette homogénéité et affecte la différenciation.

💡 Astuce mémo

Composition du milieu → destin cellulaire.

📖 9. Modèles tridimensionnels du muscle

★ À maîtriser

• Les cellules musculaires squelettiques sont post-mitotiques et possèdent plusieurs noyaux, tandis que les cellules satellites participent à la régénération musculaire.

📌 Les fibres musculaires de type I sont lentes et très rouges, avec beaucoup de myoglobine, tandis que les fibres de type II sont rapides.

• Un tissu musculaire 3D étiré présente davantage de marqueurs de différenciation et de Myh qu’un sphéroïde non étiré ; après trois jours, les cellules étirées sont plus différenciées.

Compléments

• En culture 2D, la différenciation musculaire peut être suivie avec la desmine, mais les myotubes se détachent et meurent avant de mûrir en fibres rapides.

• Dans la maladie de Charcot, ou ALS, les fibres de type II sont atrophiées avant les fibres de type I.

• Pour former un sphéroïde musculaire, des nanoparticules de fer sont introduites dans les cellules afin de les rendre magnétiques, puis des aimants les rapprochent et contribuent à mimer la tension exercée entre deux tendons.

• La tension de surface des sphéroïdes musculaires peut être calculée et comparée entre des muscles sains et pathologiques.

• Les desminopathies sont associées à une rigidité accrue, une capacité de contraction réduite et une faiblesse musculaire.

• Dans un modèle de microtissu musculaire, des cellules placées sur deux lamelles sont mises en contact en rapprochant les lamelles, puis étirées en tirant celles-ci afin de mimer la tension musculaire.

📌 Les sphéroïdes ne reproduisent pas les alignements d’actine associés à la tension, contrairement aux microtissus dans lesquels ces alignements et la tension peuvent être étudiés.

• L’optogénétique peut augmenter l’expression de la myosine rapide, mais produit des muscles peu spécialisés.

💡 Astuce mémo

Étirement → tension → différenciation musculaire accrue.

📖 10. Jonction neuromusculaire et maladie de Charcot

★ À maîtriser

• La jonction neuromusculaire ne peut pas être étudiée en culture 2D, tandis que des sphères neuromésodermales dérivées d’iPSC peuvent réunir différents types de cellules neuronales et musculaires.

• La maladie de Charcot est associée à une dégénérescence des motoneurones qui affecte le muscle et présente une forte hétérogénéité génétique ; C9orf72 et SOD1 sont les gènes les plus souvent mutés.

• L’acétylcholine déclenche la contraction du muscle in vitro, tandis que la BTX bloque cet effet et empêche la contraction.

Compléments

• Chez les patients atteints d’ALS, l’aire des neurites est modifiée et des agrégats de TDP43 sont observés par comparaison avec des personnes saines.

• Dans un modèle de jonction neuromusculaire, des iPSC sont mises dans un gel auquel un velcro est ajouté pour mimer la tension observée dans les cellules musculaires.

• L’augmentation du diamètre des fibres, leur striation et leur alignement sont associés à l’expression de la myosine rapide.

• La réponse du muscle à l’acétylcholine en présence d’une inhibition par la BTX est présentée comme un indice de maturation et de formation d’une jonction neuromusculaire fonctionnelle.

• Les co-cultures utilisées pour étudier l’ALS associent des motoneurones sains à des muscles malades ou des motoneurones malades à des muscles sains.

💡 Astuce mémo

Acétylcholine déclenche la contraction ; la BTX la bloque.

📖 11. Organoïdes rétiniens

★ À maîtriser

• Un cocktail de croissance permet de différencier rapidement des organoïdes rétiniens qui miment in vitro des structures rétiniennes humaines.

Compléments

• Les organoïdes rétiniens permettent d’étudier des cellules de l’œil humain, dont l’œil est très différent de celui de la souris.

• Les organoïdes rétiniens peuvent être différenciés jusqu’à la formation de précurseurs de photorécepteurs.

📖 12. Limites et vascularisation des organoïdes

★ À maîtriser

• Quel que soit le type d’organoïde, une vascularisation insuffisante peut provoquer une hypoxie au centre des sphéroïdes.

📌 Les organoïdes ne remplacent pas idéalement les modèles animaux, mais peuvent contribuer à réduire le nombre d’animaux utilisés.

Compléments

• La vascularisation biologique peut être obtenue en ajoutant à un organoïde des cellules capables de réaliser l’angiogenèse.

• La microfluidique peut apporter des nutriments et de l’oxygène aux cellules, alors que les cultures 2D sont oxygénées sans difficulté.

• La vascularisation des organoïdes se trouve généralement autour de ceux-ci plutôt qu’en leur centre.

• Une puce microfluidique peut compartimenter les cellules endothéliales dans un compartiment et les sphéroïdes au centre, puis des facteurs de croissance sont dirigés des cellules endothéliales vers les sphéroïdes.

• L’acquisition par les mini-cerveaux de propriétés observées chez l’humain soulève une question éthique, mais cette capacité est décrite comme encore lointaine.

💡 Astuce mémo

Vascularisation insuffisante → hypoxie au centre.