Fiche de révision : PCR, marqueurs CAPS et clonage

📋 Plan du Cours

1. Hybridation des amorces PCR
2. Analyse du marqueur CAPS
3. Amplification du fragment LBO-s
4. Clonage dans pBR322

📖 1. Hybridation des amorces PCR

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR : Amplifie une région d’ADN située entre deux amorces complémentaires de brins opposés et orientées l’une vers l’autre.

★ À maîtriser

📌 Une hybridation d’amorce n’est représentée que si elle implique plus de la moitié de la séquence de l’amorce, en faisant apparaître les éventuels mésappariements.

📌 Les amorces A, B et C doivent être évaluées selon leur complémentarité avec la séquence matrice et selon leur orientation, car une hybridation seule ne suffit pas à produire une amplification PCR.

Compléments

• La séquence fournie comporte deux régions séparées par une coupure représentée par « // », avec notamment les motifs 5′-ATCTCAACGGATCCCTTGATATCCCGTTTT-3′ et 5′-CAGCATGCATTCCGATATCCCTGCAATTTC-3′.

💡 Astuce mémo

Une amorce doit s’hybrider sur un brin, tandis que deux amorces correctement orientées encadrent la région amplifiée.

📖 2. Analyse du marqueur CAPS

★ À maîtriser

• Pour analyser un marqueur CAPS, on amplifie d’abord l’ADN par PCR avec les amorces choisies, puis on digère le produit obtenu par l’enzyme de restriction TaqI avant d’observer les fragments sur un gel.

• Le produit de PCR du marqueur CAPS mesure 500 pb et contient un site de coupure TaqI qui produit des fragments de 200 pb et de 300 pb.

📌 Selon l’orientation et le positionnement des amorces, une combinaison peut produire un fragment PCR, un fragment de taille différente ou aucun produit.

Compléments

📌 Une digestion par TaqI réalisée avant la PCR ne permet pas d’obtenir le produit attendu lorsque la séquence nécessaire à l’hybridation des amorces est dégradée ou interrompue.

• La piste 2, correspondant à une PCR avec les amorces 1, 2 et 3 suivie d’une digestion par TaqI, doit présenter deux bandes de 200 pb et 300 pb pour le produit complet de 500 pb.

• La piste 3, réalisée avec les amorces 1 et 3 puis TaqI, ne présente aucune bande lorsque les deux amorces sont positionnées sur le même brin et ne permettent pas une amplification.

💡 Astuce mémo

PCR puis TaqI : 500 pb devient 300 + 200 pb.

📖 3. Amplification du fragment LBO-s

★ À maîtriser

• 🔄 Les trois premiers cycles comprennent:

  1. Hybridation des amorces sur les matrices
  2. Élongation des brins complémentaires
  3. Génération progressive du fragment délimité par les amorces

• Les amorces proposées pour amplifier la partie indiquée du gène LBO-s comprennent des séquences supplémentaires en 5′ correspondant à des sites de restriction.

📌 Dans la liste proposée, les couples a+c et b+c sont indiqués comme permettant une amplification PCR, tandis que le couple a+d est indiqué comme ne produisant pas de PCR parce que les amorces sont orientées sur le même brin.

Compléments

📌 L’amorce 6 est incompatible avec la matrice proposée et ne doit pas être retenue pour réaliser la PCR.

📖 4. Clonage dans pBR322

★ À maîtriser

• Le clonage du produit PCR dans pBR322 consiste à amplifier l’insert, digérer l’insert et le vecteur avec les enzymes de restriction appropriées, puis ligaturer l’insert dans le vecteur pour former un plasmide recombinant.

📌 La compatibilité d’un couple d’amorces avec le clonage dans pBR322 dépend de la présence de sites de restriction appropriés dans les séquences ajoutées aux extrémités du produit PCR et de leur compatibilité avec le vecteur.

Compléments

• Après obtention du plasmide recombinant, les bactéries transformées sont sélectionnées sur un milieu approprié afin d’identifier celles qui portent le plasmide attendu.

• Les sites de restriction proposés comprennent:

  • EcoRI
  • BamHI
  • EcoRV
  • NdeI
  • PstI
  • PvuI
  • SalI
  • SphI

💡 Astuce mémo

Ajouter des sites de restriction aux amorces → digérer l’insert et le vecteur → ligaturer le plasmide recombinant.

📊 Tableaux de synthèse

Résultats attendus du marqueur CAPS