Fiche de révision : Techniques d’étude de la cellule

📋 Plan du Cours

1. Culture cellulaire et lignées
2. Repérage moléculaire intracellulaire
3. Autoradiographie et immunodétection
4. Western blot et immunoprécipitation
5. Cytométrie en flux

📖 1. Culture cellulaire et lignées

🔑 Notions clés & Définitions

• Culture primaire : Obtenue par prolifération de cellules dissociées à partir d’un morceau de tissu prélevé par biopsie ou explant.

★ À maîtriser

• La culture cellulaire consiste à prélever un tissu, dissocier mécaniquement et enzymatiquement ses cellules avec de la trypsine et de l’EDTA, puis les mettre en culture sur une boîte contenant des cellules nourricières et des facteurs de croissance.

• Avant la confluence, une partie de la population cellulaire est repiquée et diluée avant d’être remise en culture, ce qui permet d’obtenir une culture secondaire.

Compléments

• Les cultures cellulaires permettent notamment d’étudier:
  • La prolifération
  • La différenciation
  • La migration
  • La mort cellulaire

💡 Astuce mémo

Prélèvement → dissociation → culture primaire → repiquage → culture secondaire

📖 2. Repérage moléculaire intracellulaire

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunocytochimie : Localise une protéine antigénique à l’aide d’un anticorps marqué qui reconnaît spécifiquement l’antigène.

📝 Points essentiels

• Les molécules cellulaires peuvent être repérées par des réactions cytochimiques spécifiques, des colorants ou protéines fluorescents comme la GFP, l’autoradiographie, la cytoenzymologie, l’immunocytochimie ou des sondes nucléotidiques lors d’une hybridation in situ.

📌 Un anticorps monoclonal reconnaît un seul épitope, tandis qu’un anticorps polyclonal reconnaît plusieurs épitopes d’un même antigène ou de plusieurs antigènes.

📌 En immunocytochimie directe, le marqueur est fixé à l’anticorps qui détecte l’antigène, tandis qu’en méthode indirecte l’anticorps primaire non marqué est détecté par un anticorps secondaire marqué.

💡 Astuce mémo

Marqueur directement fixé à l’anticorps = méthode directe ; anticorps secondaire marqué = méthode indirecte

📖 3. Autoradiographie et immunodétection

📝 Points essentiels

• 🔄 L’autoradiographie repose sur la chaîne suivante:
  1. Émission de rayons gamma par les isotopes radioactifs
  2. Impression d’une émulsion photographique aux sels de bromure d’argent
  3. Formation de grains d’argent à l’emplacement des molécules radioactives

💡 Astuce mémo

Des grains d’argent se superposent aux molécules radioactives dans la coupe cellulaire

📖 4. Western blot et immunoprécipitation

🔑 Notions clés & Définitions

• Western blot : Recherche la présence d’une protéine dans un échantillon biologique après séparation des protéines et immunodétection sur membrane.
• Immunoprécipitation : Extrait et purifie une protéine d’intérêt en formant un complexe antigène-anticorps précipitable.

★ À maîtriser

• 🔄 Le western blot suit plusieurs étapes:
  1. Lyse et dénaturation des protéines au SDS
  2. Séparation par électrophorèse SDS-PAGE selon la masse moléculaire apparente
  3. Transfert sur une membrane
  4. Détection par incubation avec un anticorps primaire puis secondaire

Compléments

• Le western blot renseigne sur:

  • La présence ou l’absence de la protéine
  • Le poids moléculaire apparent de la protéine
  • La quantité relative de la protéine dans l’échantillon

• En ChIP, l’objectif est d’identifier une interaction entre une protéine et l’ADN.

💡 Astuce mémo

Western blot : détecter une protéine ; immunoprécipitation : la capturer et rechercher ses partenaires

📖 5. Cytométrie en flux

🔑 Notions clés & Définitions

• Cytométrie en flux : Méthode d’analyse automatique de cellules individuelles entraînées par un flux liquide, permettant d’étudier précisément des cellules isolées.

★ À maîtriser

• En cytométrie en flux, les cellules marquées passent une à une et à grande vitesse dans un faisceau laser, puis la lumière diffusée ou fluorescente est mesurée pour classer et éventuellement trier la population.

• Un cytomètre en flux comprend:

  • Un réseau fluidique
  • Un banc optique
  • Un microprocesseur

📌 L’iodure de propidium rend l’ADN fluorescent, ce qui permet d’identifier et de trier les cellules selon leur quantité d’ADN et leur phase du cycle cellulaire, par exemple pour récupérer des cellules en phase G2.

Compléments

• La diffraction dépend notamment de:
  • La taille cellulaire
  • La forme cellulaire
  • La granulosité
  • La composition membranaire

💡 Astuce mémo

Marquer → faire passer une cellule à la fois → mesurer → classer → trier

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des méthodes immunologiques