Fiche de révision : Méthodes de biologie cellulaire

📋 Plan du Cours

1. Micro-organismes comme modèles biologiques
2. Modèles animaux en laboratoire
3. Transgénèse classique chez la souris
4. Recombinaison homologue et mutations ciblées
5. Modification génomique par CRISPR
6. Cultures de cellules eucaryotes
7. Cellules souches et reprogrammation
8. Vecteurs d’expression génétique
9. Introduction d’ADN dans les cellules
10. Comparaison des modèles expérimentaux

📖 1. Micro-organismes comme modèles biologiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Virus : Machines biologiques qui injectent leur ADN dans une cellule eucaryote et détournent sa machinerie pour se multiplier.
• Transcriptase inverse : Enzyme qui synthétise de l’ADN à partir d’un ARN, notamment utilisée en RT-PCR.

📝 Points essentiels

• Les micro-organismes sont utiles en laboratoire parce qu’ils sont nombreux, peu encombrants, se reproduisent rapidement et sont facilement modifiables génétiquement.

• Pour amplifier un plasmide bactérien, on introduit le plasmide dans une bactérie, on sélectionne les bactéries résistantes à l’antibiotique, on les cultive, puis on extrait et purifie le plasmide.

📌 Les bactéries produisent efficacement des protéines recombinantes simples, mais elles ne réalisent pas correctement les modifications post-traductionnelles nécessaires aux protéines complexes.

📖 2. Modèles animaux en laboratoire

★ À maîtriser

• Drosophila melanogaster est un modèle génétique utile grâce à son cycle reproductif rapide, sa descendance abondante et son homologie importante avec l’Homme.

• Caenorhabditis elegans est un nématode d’environ 1 mm qui a notamment permis de comprendre la mort cellulaire programmée, ou apoptose.

• La souris est utilisée pour étudier la biologie des mammifères et les maladies humaines, mais son cycle de gestation dure 3 semaines et sa maturité sexuelle nécessite plusieurs semaines.

• La souris Nude porte une mutation du gène Foxn1, présente un thymus déficient et permet de greffer des cellules cancéreuses humaines sans rejet immunitaire immédiat.

Compléments

• La souris Trembler porte une mutation du gène Pmp22 et sert à étudier les maladies humaines touchant la fabrication de la gaine de myéline.

📖 3. Transgénèse classique chez la souris

🔑 Notions clés & Définitions

• Transgénèse : Introduction d’un ou plusieurs gènes dans un organisme afin qu’ils y soient exprimés.

★ À maîtriser

• 🔄 La transgénèse classique chez la souris se déroule en plusieurs étapes.:
  1. Injecter de l’ADN linéaire dans le pronucléus d’un ovocyte fécondé
  2. Réimplanter l’embryon dans une femelle porteuse
  3. Cribler les souriceaux pour détecter le transgène

📌 La transgénèse classique entraîne une intégration aléatoire du transgène, dont le nombre de copies, le site d’intégration et le niveau d’expression ne sont pas maîtrisés.

Compléments

• Un gène rapporteur placé sous le contrôle du promoteur d’un gène permet de visualiser le lieu et le moment d’expression de ce gène.

💡 Astuce mémo

Injecter, réimplanter, cribler

📖 4. Recombinaison homologue et mutations ciblées

🔑 Notions clés & Définitions

• Recombinaison homologue : Insertion d’un transgène dans une région génomique ciblée grâce à des séquences homologues entre le vecteur et l’ADN cellulaire.

★ À maîtriser

• Les cellules embryonnaires ES ayant intégré le transgène sont sélectionnées par résistance à un antibiotique, réinjectées dans un blastocyste, puis implantées dans une femelle porteuse pour obtenir des souris chimères.

📌 Un KO inactive un gène, tandis qu’un KI remplace ce gène par un transgène, un gène rapporteur ou une version modifiée.

Compléments

• L’inactivation ciblée du gène de la myostatine chez la souris entraîne une croissance accrue des muscles et permet d’étudier la régulation de leur taille.

💡 Astuce mémo

KO inactive, KI remplace

📖 5. Modification génomique par CRISPR

🔑 Notions clés & Définitions

• CRISPR : Répétitions palindromiques régulièrement espacées du génome bactérien qui participent à une défense contre les séquences d’ADN viral.

★ À maîtriser

• Dans CRISPR, l’ARNsg reconnaît la séquence cible, recrute Cas9 grâce au tracrRNA, puis Cas9 coupe les deux brins de l’ADN en amont de la séquence PAM.

📌 La réparation NHEJ de la coupure CRISPR provoque des insertions ou délétions aléatoires conduisant souvent à un KO, tandis que la réparation HDR utilise un ADN donneur homologue pour réaliser un KI.

Compléments

• CRISPR peut être réalisé directement au stade d’ovocyte fécondé et permet de cibler précisément une mutation chez la souris ou chez d’autres organismes.

💡 Astuce mémo

ARNsg, Cas9, coupure, réparation

📖 6. Cultures de cellules eucaryotes

🔑 Notions clés & Définitions

• Inhibition de contact : Arrêt de la division des cellules lorsqu’elles se touchent et que la culture devient confluente.
• Sénescence : Arrêt progressif de la prolifération et mort des cellules après un certain nombre de divisions, notamment en raison du raccourcissement des télomères.

★ À maîtriser

• Une culture primaire est obtenue à partir de cellules prélevées par biopsie ou prise de sang et placées dans un milieu adapté, puis le repiquage consiste à détacher, diluer et transférer les cellules dans de nouvelles boîtes.

Compléments

• Les conditions nécessaires à la culture cellulaire comprennent:
  • des acides aminés
  • des sucres
  • des facteurs de croissance
  • des ions minéraux
  • un pH adapté
  • une atmosphère contrôlée
  • une température d’environ 37 °C

💡 Astuce mémo

Confluence → inhibition de contact → repiquage

📖 7. Cellules souches et reprogrammation

🔑 Notions clés & Définitions

• Cellules IPS : Cellules différenciées reprogrammées vers un état pluripotent sans destruction d’un embryon.

★ À maîtriser

📌 Les cellules souches totipotentes peuvent produire un organisme entier et ses annexes embryonnaires, les pluripotentes produisent tous les types cellulaires sauf les annexes embryonnaires, les multipotentes produisent plusieurs types d’un lignage et les unipotentes un seul type cellulaire.

• Les cellules ES sont des cellules pluripotentes provenant de la masse interne d’un blastocyste et peuvent donner tous les types cellulaires de cette masse interne.

Compléments

• La reprogrammation d’une cellule différenciée en cellule IPS nécessite la présence de quatre facteurs de transcription et peut permettre d’obtenir des neurones à partir de cellules de peau ou de sang.

💡 Astuce mémo

ES détruit le blastocyste, IPS reprogramme une cellule

📖 8. Vecteurs d’expression génétique

🔑 Notions clés & Définitions

• Vecteur d’expression : Portion d’acide nucléique exogène qui permet d’exprimer un gène dans une cellule hôte.
• Surexpression : Production d’un gène en quantité supérieure à la normale, notamment grâce à un vecteur portant un promoteur puissant.

📝 Points essentiels

• Un vecteur d’expression contient généralement un promoteur eucaryote et l’ADNc correspondant à l’ARNm d’intérêt.

• L’ADNc est obtenu par rétrotranscription d’un ARNm déjà épissé grâce à une transcriptase inverse, puis il peut être transcrit dans le noyau de la cellule hôte.

📖 9. Introduction d’ADN dans les cellules

★ À maîtriser

📌 La micro-injection introduit l’ADN cellule par cellule, tandis que l’électroporation permet de traiter plusieurs cellules simultanément grâce à une déstabilisation brève de la bicouche lipidique par champ électrique.

Compléments

• La lipofection utilise des bulles lipidiques qui enferment l’ADN et fusionnent avec la membrane cellulaire pour le libérer dans la cellule.

• Le bombardement avec des particules d’or ou de tungstène introduit l’ADN en projetant des particules recouvertes d’ADN à travers la membrane plasmique.

📌 L’électroporation doit être appliquée pendant quelques millisecondes et avec une intensité contrôlée, car un traitement trop fort peut tuer les cellules.

📖 10. Comparaison des modèles expérimentaux

★ À maîtriser

📌 Les bactéries amplifient rapidement des plasmides et produisent des protéines simples, les levures modélisent les mécanismes eucaryotes, les cellules en culture analysent les mécanismes à l’échelle cellulaire et moléculaire, et les animaux modélisent les interactions entre tissus et organismes.

📌 Les cellules transformées peuvent proliférer en hauteur ou en suspension, s’autostimuler sans facteurs de croissance, ignorer l’inhibition de contact et former une lignée continue, contrairement aux cellules primaires non transformées.

Compléments

• Escherichia coli est la principale bactérie utilisée en laboratoire, tandis que Saccharomyces cerevisiae est un organisme eucaryote unicellulaire de choix pour les études génétiques et biochimiques.

• Les cellules HeLa constituent une lignée cellulaire continue issue d’un cancer humain et encore utilisée dans les laboratoires.

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des méthodes de transgénèse

Comparaison des modèles biologiques