Fiche de révision : Méthodes d’étude de la cellule

📋 Plan du Cours

1. Principes de la microscopie photonique
2. Résolution et profondeur de champ
3. Matériel d’observation microscopique
4. Compléments optiques
5. Préparation des échantillons
6. Techniques de coupe
7. Colorations et histo-enzymologie
8. Marquages spécifiques cellulaires
9. Hybridation in situ

📖 1. Principes de la microscopie photonique

🔑 Notions clés & Définitions

• Grossissement utile : le grossissement qui permet à l’œil de distinguer distinctement les détails les plus fins
• Observation microscopique : L’observation au microscope photonique se fait par transparence, tandis que l’observation en lumière réfléchie concerne les objets opaques avec une loupe binoculaire

📝 Points essentiels

• Les microscopes photoniques utilisent la lumière visible, dont la longueur d’onde est comprise entre 390 et 760 nm.

📌 Les microscopes photoniques par transmission permettent l’observation directe de structures mesurant jusqu’à environ 0,2 μm, tandis que les microscopes confocaux produisent des images tridimensionnelles grâce à un balayage laser et à un traitement informatique.

💡 Astuce mémo

Lumière visible : 390–760 nm ; en dessous UV, au-dessus infrarouge

📖 2. Résolution et profondeur de champ

🔑 Notions clés & Définitions

• Profondeur de champ : la zone comprise entre le premier et le dernier plan net d’une image
• Limite de résolution : la plus petite distance entre deux objets permettant de les distinguer dans les meilleures conditions d’observation

★ À maîtriser

• Plus le grossissement augmente, plus la profondeur de champ diminue : elle est de 25 μm pour un grossissement de 25 et de 0,6 μm pour un grossissement de 1000.

Compléments

• La résolution de l’œil humain est d’environ 75 μm à 25 cm, tandis que celle d’une loupe binoculaire est voisine de 2 μm.

💡 Astuce mémo

Longueur d’onde plus courte → limite de résolution plus faible → meilleure résolution

📖 3. Matériel d’observation microscopique

★ À maîtriser

📌 La loupe binoculaire observe les objets opaques en lumière réfléchie ou les objets transparents, avec une limite de résolution d’environ 2 μm et un grossissement utile d’environ x200.

• Dans un microscope photonique classique, la lumière traverse l’échantillon, le condenseur la concentre, l’objectif agrandit et renverse l’image, puis l’oculaire l’agrandit une seconde fois pour former une image virtuelle.

📐 Formule — Le grossissement total est égal au produit du grossissement de l’objectif et de celui de l’oculaire : $G_{total}=G_{objectif}\times G_{oculaire}$.

• Le microscope photonique classique observe par transparence des échantillons de moins de 10 μm, avec une limite de résolution pouvant atteindre 0,2 μm et un grossissement utile de x40 à x1250.

• Le microscope confocal utilise un balayage laser, réduit la lumière provenant des plans défocalisés et permet une reconstruction informatique en trois dimensions.

Compléments

• Un objectif à immersion utilise un liquide dont l’indice de réfraction est proche de celui du verre, ce qui améliore la résolution.

• Le microscope photonique inversé éclaire l’objet par le haut et place l’objectif en dessous pour observer des cellules en culture à travers le fond d’une boîte transparente.

💡 Astuce mémo

Source → condenseur → objectif → oculaire → image virtuelle

📖 4. Compléments optiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Épifluorescence : utilise une lumière excitatrice sélectionnée par des filtres pour faire émettre aux objets fluorescents une lumière de longueur d’onde plus grande, ensuite recueillie par l’objectif

★ À maîtriser

• Le contraste de phase sélectionne la lumière déviée par l’objet grâce à un anneau clair dans le condenseur et un anneau sombre dans l’objectif, ce qui permet d’observer des cellules vivantes sans préparation ni coloration.

📌 Le contraste interférentiel utilise une lumière polarisée dédoublée puis recomposée, donnant une meilleure résolution et aucun halo lumineux, mais une fausse impression de relief.

• Le fond noir bloque la lumière directe avec un condenseur opaque au centre et ne laisse observer que la lumière diffusée par l’objet, notamment les bactéries sous forme de points brillants.

• En polarisation, des lames parallèles permettent une transmission totale de la lumière, tandis que des lames perpendiculaires entraînent une extinction totale.

Compléments

• La polarisation utilise un polariseur avant le condenseur et un analyseur après l’objet pour visualiser les structures biréfringentes comme les cristaux d’acide urique ou de phosphate de calcium.

• Le DAPI est un fluorochrome excitable dans les ultraviolets qui s’incorpore à l’ADN et émet une fluorescence bleue.

💡 Astuce mémo

Phase : halo et résolution moindre ; interférentiel : relief apparent et meilleure résolution

📖 5. Préparation des échantillons

🔑 Notions clés & Définitions

• Fixation : préserve les structures au plus proche du vivant, durcit les pièces, arrête les réactions biologiques et provoque la mort cellulaire

★ À maîtriser

• 🔄 Les préparations suivent deux séquences:
  1. Cellules : étalement
  2. Cellules : fixation
  3. Cellules : coloration
  4. Tissus : fixation
  5. Tissus : inclusion
  6. Tissus : coupe
  7. Tissus : coloration

📌 Les fixateurs coagulants, comme le méthanol, l’éthanol et l’acide acétique, coagulent les protéines, tandis que les fixateurs additifs, comme l’acide picrique, les aldéhydes et le tétroxyde d’osmium, créent des pontages chimiques entre les protéines.

Compléments

• La fixation progresse à raison d’environ 1 mm de pénétration par heure, et une fixation rapide améliore sa qualité.

• Les principales préparations fixatrices sont:

  • Formol tamponné
  • Liquide de Bouin
  • Carnoy

💡 Astuce mémo

Cellules : ETAFIXCO ; tissus : FIXINCOUCO

📖 6. Techniques de coupe

★ À maîtriser

• L’inclusion en paraffine lave le tissu, le déshydrate par des alcools de concentration croissante, le clarifie avec un solvant organique, puis remplace ce solvant par de la paraffine liquide avant refroidissement en bloc.

• L’inclusion en paraffine utilise une paraffine liquide chauffée à 56 °C et dure entre 36 et 48 heures.

• Le bloc de paraffine est coupé au microtome en lames de 4 à 6 μm, après décalcification préalable des os par un acide faible.

📌 La technique en paraffine conserve bien les structures et donne de bonnes images, mais elle est lente, dissout les petites molécules et la plupart des lipides, et arrête les activités biologiques.

📌 La technique en congélation coupe les tissus avec un cryo-microtome vers -20 °C, permet un examen extemporané et maintient l’activité biochimique, mais donne des images de qualité moindre et ne permet pas une conservation prolongée.

Compléments

• La coloration d’une lame comprend la suppression de la paraffine par le toluène, la réhydratation par des alcools de concentration décroissante, l’application d’un colorant aqueux puis un rinçage à l’eau.

• Le montage déshydrate de nouveau la préparation, puis une résine hydrophobe d’indice de réfraction identique au verre est placée entre la lame et la lamelle pour assurer la conservation et améliorer la visibilité.

💡 Astuce mémo

Paraffine : qualité et conservation ; congélation : rapidité et activité biologique

📖 7. Colorations et histo-enzymologie

🔑 Notions clés & Définitions

• Métachromasie : la propriété d’un colorant de changer de couleur selon le pH des molécules auxquelles il se fixe

★ À maîtriser

📌 Les colorations vitales sont réalisées sur des cellules vivantes avec des colorants peu ou pas toxiques, tandis que l’éosine-nigrosine colore les cellules mortes devenues perméables.

📌 Les colorants acides, anioniques, se fixent sur les molécules basiques et colorent les structures acidophiles, tandis que les colorants basiques, cationiques, se fixent sur les molécules acides et colorent les structures basophiles.

• La coloration de Feulgen-Rosenbeck met en évidence l’ADN et son intensité est proportionnelle à la quantité d’ADN présente.

• La technique PAS met en évidence les sucres complexes grâce à la fuchsine, tandis que les monosaccharides et les glucides simples sont éliminés.

• L’histo-enzymologie révèle une activité enzymatique lorsqu’une enzyme transforme un substrat en un produit insoluble et coloré, et elle s’utilise sur du matériel frais ou congelé non fixé.

Compléments

• Les colorations argentiques mettent en évidence la mélanine, les amines biogènes et les neurofibrilles, tandis que la coloration de Perl’s met en évidence le fer.

💡 Astuce mémo

Substrat enzymatique → produit insoluble coloré → présence de l’enzyme

📖 8. Marquages spécifiques cellulaires

🔑 Notions clés & Définitions

• Immuno-histochimie : localise des protéines cellulaires grâce à des anticorps qui se lient spécifiquement aux antigènes correspondants

📝 Points essentiels

📌 Les anticorps polyclonaux sont hétérogènes et reconnaissent plusieurs épitopes d’un antigène, tandis que les anticorps monoclonaux sont homogènes et reconnaissent un seul épitope.

• En immunofluorescence directe, un anticorps spécifique couplé à un fluorochrome se fixe directement à l’antigène puis est observé en épifluorescence.

• En immunofluorescence indirecte, un anticorps primaire non marqué se fixe à l’antigène, puis un anticorps secondaire fluorescent dirigé contre les immunoglobulines se fixe à l’anticorps primaire.

💡 Astuce mémo

Immunofluorescence directe : anticorps marqué ; indirecte : anticorps secondaire marqué

📖 9. Hybridation in situ

🔑 Notions clés & Définitions

• Hybridation in situ : met en évidence des séquences définies d’ADN ou d’ARN grâce à des sondes d’acides nucléiques marquées et complémentaires de la séquence cible

★ À maîtriser

• En hybridation in situ, les sondes et l’ADN cible sont dénaturés par la chaleur, puis les sondes complémentaires se fixent à la séquence recherchée et produisent un marquage si celle-ci est présente.

Compléments

• Le marquage des sondes d’hybridation in situ peut utiliser un isotope, rarement, ou un colorant fluorescent dans la technique FISH.

💡 Astuce mémo

Séquence complémentaire présente → fixation de la sonde → coloration visible

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des techniques de coupe