Fiche de révision : Biologie moléculaire : réplication et expression

📋 Plan du Cours

1. Expérience de réplication de l’ADN
2. Modèles de réplication
3. PCR et amorces spécifiques
4. Électrophorèse et mutations
5. Séquençage de Sanger
6. Transcription bactérienne
7. Éléments et régulation transcriptionnels
8. Mutations et expression protéique
9. Traduction in vitro
10. Régulation eucaryote par p53

📖 1. Expérience de réplication de l’ADN

🔑 Notions clés & Définitions

• Bromure d’éthidium : Agent intercalant qui s’insère entre les paires de bases de l’ADN et devient fluorescent sous illumination aux UV, ce qui permet de visualiser l’ADN.
• Gradient de chlorure de césium : Gradient formé par centrifugation qui sépare les molécules d’ADN selon leur densité, chaque molécule se positionnant dans la zone dont la densité est égale à la sienne.

📝 Points essentiels

• La 5-bromodésoxyuridine (5-BrdU) est un analogue structural de la thymidine dans lequel un atome de brome remplace le groupement méthyle porté par le carbone 5.

• La densité optique à 600 nm permet d’évaluer la croissance bactérienne jusqu’à une valeur d’environ 1 ; lorsque la DO double en 20 minutes, la population bactérienne double pendant ces 20 minutes.

💡 Astuce mémo

5-BrdU → thymidine → centrifugation → bandes

📖 2. Modèles de réplication

📝 Points essentiels

📌 Le modèle conservatif conserve entièrement le duplex parental et produit un duplex entièrement nouveau, le modèle semi-conservatif associe un brin parental et un brin néoformé dans chaque duplex, tandis que le modèle dispersif mélange des segments parentaux et néoformés dans chaque brin.

• L’expérience de Meselson et Stahl, réalisée en 1958, a permis de déterminer le modèle effectivement utilisé pour la réplication de l’ADN. — Messelson et Stahl

💡 Astuce mémo

Conservatif garde le duplex, semi-conservatif le partage, dispersif le mélange

📖 3. PCR et amorces spécifiques

🔑 Notions clés & Définitions

• PCR : Technique qui amplifie spécifiquement une région d’ADN délimitée par deux amorces, afin d’obtenir de nombreuses copies de cette région.

📝 Points essentiels

• 🔄 Un cycle de PCR comprend les étapes suivantes:

  1. Dénaturation des deux brins d’ADN
  2. Hybridation des amorces sur leurs séquences complémentaires
  3. Élongation des nouveaux brins par une ADN polymérase

• Dans le cours, la région du gène p53 amplifiée par PCR a une longueur de 300 paires de bases.

💡 Astuce mémo

Dénaturation → hybridation → élongation

📖 4. Électrophorèse et mutations

🔑 Notions clés & Définitions

• Électrophorèse : Sépare les fragments d’acides nucléiques selon leur taille et grâce à leur charge, laquelle provient des groupements phosphates.

📝 Points essentiels

• Les acides nucléiques portent une charge globale négative en raison de leurs groupements phosphates et migrent vers l’électrode positive lors d’une électrophorèse.

📌 Lors d’une électrophorèse, les fragments d’ADN de petite taille migrent plus rapidement et plus loin dans le gel que les fragments de grande taille.

💡 Astuce mémo

Petits fragments migrent plus loin ; substitutions gardent la taille, insertions et délétions la modifient

📖 5. Séquençage de Sanger

📝 Points essentiels

• Le séquençage de Sanger produit des fragments d’ADN arrêtés par l’incorporation aléatoire de didésoxynucléotides, puis sépare ces fragments et permet de lire la séquence selon l’ordre des fragments.

📌 La présence de deux pics à une même position dans un chromatogramme de séquençage peut traduire la présence de deux séquences différentes, ce qui est compatible avec un individu hétérozygote.

💡 Astuce mémo

Un terminateur ddNTP arrête chaque fragment à une base

📖 6. Transcription bactérienne

🔑 Notions clés & Définitions

• Promoteur : Région de l’ADN nécessaire à l’initiation de la transcription par l’ARN polymérase.

📝 Points essentiels

• La transcription in vitro utilise une matrice d’ADN, une ARN polymérase et les quatre ribonucléotides triphosphates, dont l’un peut être marqué au 32P pour détecter l’ARN produit par autoradiographie.

• Dans l’exercice sur le fragment C, les séquences TTGACA et TATAAT sont étudiées comme des éléments nécessaires à l’initiation de la transcription bactérienne.

💡 Astuce mémo

Promoteur reconnu → initiation → ARN synthétisé

📖 7. Éléments et régulation transcriptionnels

📝 Points essentiels

📌 La suppression de la séquence située à +800 permet d’étudier son rôle dans l’élongation ou la terminaison de la transcription, et non directement l’initiation.

💡 Astuce mémo

Le promoteur initie, la région régulatrice module

📖 8. Mutations et expression protéique

🔑 Notions clés & Définitions

• Cadre ouvert de lecture : Séquence comprise entre un codon d’initiation et un codon STOP, susceptible d’être traduite en protéine.

📝 Points essentiels

📌 Une substitution remplace un nucléotide par un autre sans modifier nécessairement la longueur de la séquence, tandis qu’une insertion ajoute des nucléotides et qu’une délétion en retire.

📌 Une insertion ou une délétion dont la longueur n’est pas un multiple de trois décale le cadre de lecture et peut faire apparaître un codon STOP prématuré.

💡 Astuce mémo

Insertion ou délétion non multiple de trois décale le cadre, substitution peut être silencieuse

📖 9. Traduction in vitro

📝 Points essentiels

📌 Dans l’expérience de traduction in vitro, l’ARN ajouté est un ARNm, car il sert directement de matrice à la synthèse d’une protéine.

• Le SDS charge les protéines négativement afin de permettre leur séparation électrophorétique principalement selon leur taille.

📐 Formule — Pour une protéine dont la masse moyenne d’un acide aminé est de 110 Da, le nombre d’acides aminés est obtenu par $n = \frac{M}{110}$.

📌 Une insertion de 20 paires de bases dans une séquence codante décale le cadre de lecture, tandis qu’une insertion de 30 paires de bases, multiple de trois, conserve le cadre de lecture mais ajoute des acides aminés.

💡 Astuce mémo

ARNm → codon AUG → acides aminés → codon STOP

📖 10. Régulation eucaryote par p53

🔑 Notions clés & Définitions

• Facteurs généraux de transcription : Nécessaires à l’assemblage et au fonctionnement du complexe d’initiation avec l’ARN polymérase eucaryote.
• Facteur spécifique p53 : Se fixe sur une séquence régulatrice située à -150 et stimule la transcription dans l’expérience réalisée avec la matrice 1.

📝 Points essentiels

📌 Une bande d’autoradiographie plus épaisse indique une plus grande quantité de transcrit, et non un transcrit de plus grande taille.

• La présence de p53 augmente la transcription lorsque la séquence régulatrice située à -150 est présente, mais cet effet disparaît lorsque cette séquence est retirée de la matrice 2.

💡 Astuce mémo

p53 sur la région régulatrice → transcription stimulée

📊 Tableaux de synthèse

Techniques et signaux détectés