Fiche de révision : Clonage moléculaire et analyse de l’expression

📋 Plan du Cours

1. ADNc et stratégies de clonage
2. Plasmides et enzymes de restriction
3. Analyse des plasmides recombinants
4. Transcription in vitro de l’ADN cloné
5. Northern blot et sonde ARN

📖 1. ADNc et stratégies de clonage

📝 Points essentiels

• L’ADNc X provient de l’ARN messager codant pour la protéine X humaine et possède des extrémités franches.

• Le clonage consiste à intégrer un vecteur recombinant dans une bactérie afin que le vecteur se réplique et se multiplie avec les bactéries.

• Deux stratégies de sous-clonage de la totalité de la séquence de l’ADNc X dans pGEM sont possibles : utiliser les sites HindIII et EcoRV, ou utiliser les sites HindIII et BamHI.

💡 Astuce mémo

ADNc → vecteur → bactérie → amplification

📖 2. Plasmides et enzymes de restriction

🔑 Notions clés & Définitions

• Enzyme de restriction : Endonucléase qui coupe les deux brins d’une molécule d’ADN en des sites précis.
• Plasmide : Molécule d’ADN bactérienne circulaire à double brin, capable de réplication autonome grâce à des séquences particulières.
• Plasmide d’expression : Vecteur de clonage auquel un promoteur a été ajouté pour permettre l’expression de l’ADN inséré.
• ADN ligase : Enzyme qui forme une liaison phosphodiester covalente entre une extrémité 5’ phosphate et une extrémité 3’ hydroxyle d’un ADN double brin.

📝 Points essentiels

• Les éléments cités d’un vecteur de clonage sont: un site multiple de clonage contenant des sites de restriction, un gène de sélection, notamment de résistance à un antibiotique, un promoteur dans les vecteurs d’expression

💡 Astuce mémo

Restriction = couper ; ligase = relier

📖 3. Analyse des plasmides recombinants

★ À maîtriser

• La taille des fragments issus des digestions enzymatiques est déterminée en comparant leur distance de migration à celle de fragments marqueurs sur une droite étalon semi-logarithmique.

• La carte de restriction du plasmide recombinant est établie à partir des tailles de fragments obtenues après digestions simples, doubles et triples, puis les sites de restriction, l’ATG initiateur et le codon STOP sont positionnés.

Compléments

• Les fragments d’ADN séparés par électrophorèse sur gel d’agarose sont détectés grâce à un composé intercalant.

• Le plasmide non digéré peut se présenter sous une forme relâchée ou superenroulée, et sa topologie modifie sa migration sur gel, ce qui le rend impropre à une mesure directe comparable aux fragments digérés.

💡 Astuce mémo

Digestion → électrophorèse → taille → carte

📖 4. Transcription in vitro de l’ADN cloné

📝 Points essentiels

• Les promoteurs T7 et Sp6 sont reconnus spécifiquement par les ARN polymérases des bactériophages T7 et Sp6 et encadrent l’ADNc cloné.

• 🔄 La transcription in vitro comprend:

  1. choisir le promoteur T7 ou Sp6
  2. utiliser l’ARN polymérase correspondante
  3. ajouter un mélange de NTP
  4. produire l’ARN à partir de l’ADNc cloné

💡 Astuce mémo

T7 et Sp6 encadrent l’insert, mais orientent des transcriptions opposées

📖 5. Northern blot et sonde ARN

🔑 Notions clés & Définitions

• Northern blot : Technique qui détecte un ARN spécifique au sein d’un mélange d’ARN par hybridation moléculaire avec une sonde complémentaire marquée.

★ À maîtriser

• 🔄 Les étapes du Northern blot sont: électrophorèse des ARN totaux sur gel d’agarose, transfert des ARN sur une membrane de nylon, fixation des ARN par exposition aux UV, préhybridation de la membrane, hybridation avec une sonde spécifique marquée, lavage, révélation

• Pour synthétiser une sonde ARN marquée à la digoxigénine, le plasmide est linéarisé en aval de l’insert, puis transcrit in vitro avec l’ARN polymérase Sp6, de l’ATP, du CTP, du GTP, de l’UTP et une fraction d’UTP couplé à la digoxigénine.

Compléments

📌 Une sonde radioactive est révélée par autoradiographie, tandis qu’une sonde froide marquée à la digoxigénine est révélée par une méthode adaptée à ce marquage.

💡 Astuce mémo

Séparer → transférer → hybrider → laver → révéler