De quoi provient l'ADNc X ?
De l'ARN messager codant pour la protéine X humaine.
Quelles extrémités possède l'ADNc X ?
Des extrémités franches.
En quoi consiste le clonage dans une bactérie ?
À intégrer un vecteur recombinant pour qu'il se réplique avec la bactérie.
Quelles sont les deux stratégies de sous-clonage de l'ADNc X dans pGEM ?
Utiliser les sites HindIII et EcoRV ou HindIII et BamHI.
Qu'est-ce qu'une enzyme de restriction ?
C'est une endonucléase qui coupe l'ADN en sites précis.
Qu'est-ce qu'un plasmide bactérien ?
Une molécule d'ADN circulaire double brin capable de réplication autonome.
Que contient un plasmide de clonage ?
Un site multiple de clonage, un gène de sélection et parfois un promoteur.
Quel gène confère une résistance dans un plasmide de clonage ?
Un gène de sélection conférant une résistance à un antibiotique.
Qu'est-ce qu'un plasmide d'expression ?
Un vecteur de clonage avec un promoteur pour exprimer l'ADN inséré.
Quelle fonction a l'ADN ligase ?
Elle forme une liaison phosphodiester entre extrémités 5' phosphate et 3' hydroxyle.
Comment détecte-t-on les fragments d'ADN sur gel d'agarose ?
Grâce à un composé intercalant.
Comment détermine-t-on la taille des fragments d'ADN après digestion enzymatique ?
En comparant leur distance de migration à celle de fragments marqueurs sur une droite étalon semi-logarithmique.
Comment établit-on la carte de restriction d'un plasmide recombinant ?
À partir des tailles de fragments obtenues après digestions simples, doubles et triples.
Que positionne-t-on sur la carte de restriction après avoir établi les tailles des fragments ?
Les sites de restriction, l'ATG initiateur et le codon STOP.
Sous quelles formes peut se présenter un plasmide non digéré ?
Sous une forme relâchée ou superenroulée.
Quel effet la topologie du plasmide non digéré a-t-elle sur sa migration sur gel ?
Elle modifie sa migration, rendant la mesure directe impropre.
Quels promoteurs sont reconnus par les ARN polymérases T7 et Sp6 ?
Les promoteurs T7 et Sp6.
Que reconnaissent spécifiquement les ARN polymérases des bactériophages T7 et Sp6 ?
Les promoteurs T7 et Sp6.
Que délimitent les promoteurs T7 et Sp6 dans l’ADNc cloné ?
Ils encadrent l’ADNc cloné.
Quels éléments sont nécessaires pour la transcription in vitro du plasmide recombinant ?
Le promoteur T7 ou Sp6, l’ARN polymérase correspondante et un mélange de NTP.
Quel est le produit de la transcription in vitro à partir de l’ADNc cloné ?
Un ARN.
Qu'est-ce que le Northern blot détecte ?
Un ARN spécifique dans un mélange d'ARN.
Quelles sont les étapes principales du Northern blot ?
Électrophorèse, transfert, fixation UV, hybridation, lavage, révélation.
Comment est synthétisée une sonde ARN marquée à la digoxigénine ?
Par transcription in vitro d'un plasmide linéarisé avec UTP digoxigénine.
Quelle enzyme est utilisée pour transcrire la sonde ARN marquée à la digoxigénine ?
L'ARN polymérase Sp6.
Comment se révèle une sonde radioactive ?
Par autoradiographie.
Comment se révèle une sonde marquée à la digoxigénine ?
Par une méthode adaptée au marquage à la digoxigénine.
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1. Quelle est l’origine de l’ADNc X utilisé pour produire la protéine X humaine ?
2. Quel est le résultat recherché lorsqu’un vecteur recombinant est introduit dans une bactérie au cours d’un clonage ?
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