Fiche de révision : Méthodes d’étude de la cellule

📋 Plan du Cours

1. Microscopie photonique et fluorescence
2. Microscopie confocale et inversée
3. Microscopie électronique
4. Techniques cytologiques
5. Préparation histologique des tissus
6. Coupes et coloration histologiques
7. Préparation pour microscopie électronique
8. Culture cellulaire et conditions
9. Application à la fécondation in vitro

📖 1. Microscopie photonique et fluorescence

🔑 Notions clés & Définitions

• Fluorescence : Propriété de certains corps d’émettre de la lumière après avoir absorbé des photons de plus haute énergie.

★ À maîtriser

• Le microscope photonique permet l’analyse de prélèvements tissulaires chez le patient afin de compléter un diagnostic.

📌 La fluorescence primaire, ou autofluorescence, est émise par l’objet lui-même, tandis que la fluorescence secondaire nécessite l’association de l’objet à une substance fluorescente, comme le DAPI.

Compléments

• Le microscope photonique comprend trois lentilles en verre :

  • le condenseur
  • l’objectif
  • l’oculaire

• Le microscope à fluorescence reprend les constituants du microscope photonique et ajoute un faisceau ultraviolet permettant de détecter des colorants fluorescents.

• Dans le microscope à fluorescence, les molécules fluorescentes de l’échantillon sont excitées par un faisceau lumineux, puis leur fluorescence est détectée.

💡 Astuce mémo

Fluorescence primaire : l’objet émet seul ; secondaire : un colorant fluorescent est nécessaire.

📖 2. Microscopie confocale et inversée

★ À maîtriser

• Le microscope confocal est un microscope à fluorescence amélioré dans lequel la fluorescence est générée par un laser et les signaux transmis par un pinhole permettent de reconstituer une image localisant précisément la fluorescence.

• Le microscope inversé permet d’observer des cellules vivantes non colorées en culture cellulaire.

Compléments

• Le microscope inversé équipé pour le contraste de phase possède des objectifs spéciaux qui transforment les différences de phase en différences d’amplitude.

📖 3. Microscopie électronique

★ À maîtriser

• Le microscope électronique utilise un faisceau d’électrons comme source d’éclairage et sa résolution peut atteindre 0,08 nm, voire 0,04 nm.

📌 Le MET visualise les électrons qui traversent l’échantillon et l’ombre du spécimen, tandis que le MEB détecte les électrons qui rebondissent sur celui-ci pour montrer sa surface et sa forme.

Compléments

• Le MEB produit une image de surface en trois dimensions en convertissant les électrons émis par l’échantillon en image affichée sur un écran.

• Le microscope électronique comprend trois ensembles de lentilles électromagnétiques correspondant au condenseur, à l’objectif et au projecteur, ainsi qu’une pompe à vide permettant le déplacement des électrons dans le vide.

💡 Astuce mémo

Le MET traverse l’échantillon ; le MEB balaie sa surface.

📖 4. Techniques cytologiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Techniques cytologiques : Techniques concernant les cellules libres en suspension, notamment celles du sang, de la moelle osseuse, des frottis vaginaux et du liquide céphalo-rachidien.

★ À maîtriser

• La préparation cytologique consiste à prélever les cellules par ponction, à les étaler sur une lame, à les sécher à l’air libre et à les colorer.

Compléments

• Les colorations cytologiques mentionnées sont :

  • le May-Grünwald-Giemsa (MGG)
  • le Papanicolaou
  • le bleu de méthylène

• Le MGG associe le bleu de méthylène, qui colore en bleu les constituants acides, l’azur, qui colore en rouge-violet certains constituants alcalins, et l’éosine, qui colore en rouge-orangé d’autres constituants alcalins.

📖 5. Préparation histologique des tissus

🔑 Notions clés & Définitions

• Techniques histologiques : Techniques préparant les tissus consistants, comme le foie, la peau et le muscle, par des coupes minces avant leur observation au microscope.

★ À maîtriser

• 🔄 La préparation histologique comprend les étapes suivantes :
  1. fixation
  2. imprégnation et inclusion
  3. confection des coupes
  4. coloration

📌 La fixation doit être immédiate, ou commencer très rapidement après le prélèvement, afin de conserver la morphologie cellulaire dans un état aussi proche que possible du vivant.

• L’inclusion durcit les tissus fixés en remplaçant l’eau intracellulaire par une substance solide, généralement la paraffine, après déshydratation dans des bains d’alcool à titre croissant de 70°, 95° et 100°.

Compléments

• Les fixateurs chimiques cités sont :

  • l’alcool éthylique
  • l’acide acétique
  • l’acide picrique
  • le mélange de Bouin
  • le mélange de Carnoy

• Les fixateurs physiques les plus utilisés en médecine sont l’azote liquide à −196 °C et la neige carbonique ou carboglace à −78,5 °C.

📌 Lorsqu’un échantillon est fixé par congélation, son durcissement évite l’étape d’inclusion.

💡 Astuce mémo

Fixer, durcir, couper, puis colorer.

📖 6. Coupes et coloration histologiques

★ À maîtriser

• La microtomie produit des coupes de 3 à 5 μm d’épaisseur, suffisamment fines pour être traversées par la lumière du microscope.

• La coloration histologique usuelle associe un colorant basique nucléaire, l’hématéine ou l’hématoxyline, à un colorant acide cytoplasmique, l’éosine, l’érythrosine ou la phloxine.

Compléments

• Les coupes sont réalisées au microtome, ou au cryostat pour les tissus congelés, puis étalées et collées sur des lames de verre avec de l’eau gélatineuse ou albumineuse sur une platine chauffante.

• La réhydratation histologique remplace la paraffine par du toluène pour le déparaffinage, puis utilise des bains d’alcool à titre décroissant de 100°, 95° et 70° afin de réintroduire l’eau intracellulaire.

• Le safran est souvent ajouté à la coloration histologique parce qu’il se fixe sur le collagène.

📖 7. Préparation pour microscopie électronique

★ À maîtriser

• Les coupes ultrafines destinées au MET ont une épaisseur de 50 à 80 nm et sont réalisées avec un ultramicrotome muni d’un couteau en verre ou en diamant, puis recueillies sur des grilles métalliques.

• La préparation des échantillons pour le MET utilise une double fixation au glutaraldéhyde puis au tétroxyde d’osmium afin d’éviter l’extraction de certains composants, notamment les lipides, pendant la déshydratation.

• Pour préparer un échantillon au MEB, les objets sont fixés et déshydratés, recouverts d’une mince couche conductrice de métal vaporisée sous vide, puis balayés régulièrement par un faisceau d’électrons.

Compléments

• Pour le MET, l’inclusion utilise des résines de synthèse, comme l’époxy ou l’araldite, qui sont plus dures que la paraffine et transparentes aux électrons.

• Les coupes destinées au MET sont contrastées avec des sels de métaux lourds, notamment l’osmium, le plomb et l’uranium, qui sont denses aux électrons.

📖 8. Culture cellulaire et conditions

★ À maîtriser

• 🔄 La mise en culture cellulaire comprend les étapes suivantes : prélèvement d’un fragment tissulaire vivant, dissociation des cellules par trypsination, numération cellulaire, addition d’un milieu de culture, repiquage dans un milieu neuf à une densité inférieure à celle de la confluence

📌 Les conditions de culture comprennent un pH de 7 à 7,4, une température de 37 °C et une atmosphère de 95 % d’air et 5 % de CO₂, maintenue dans une étuve pour stabiliser le pH.

Compléments

• La trypsination dissocie les cellules à l’aide d’enzymes telles que la trypsine ou la collagénase.

• La concentration indiquée pour l’addition de cellules au milieu de culture est de 10⁶ cellules pour 10 ml.

• Les composants de base des milieux de culture sont :

  • l’eau
  • les sels minéraux
  • les vitamines
  • les acides aminés ou protéines
  • le glucose
  • les antibiotiques
  • le sérum de veau fœtal
  • les facteurs de croissance

📌 La stérilité des cultures est assurée au maximum par l’utilisation d’une hotte à flux laminaire et de lampes UV germicides.

📖 9. Application à la fécondation in vitro

📝 Points essentiels

• 🔄 La fécondation in vitro décrite suit ces étapes : fécondation de l’ovocyte par le spermatozoïde, fragmentation de l’embryon obtenu in vitro, introduction d’une suspension de cellules embryonnaires dans un flacon à l’aide d’une pipette stérile, incubation du flacon pendant 24 heures à 37 °C

💡 Astuce mémo

Féconder, fragmenter, mettre en culture, puis incuber 24 heures.

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des microscopes électroniques