Fiche de révision : Méthodes d’étude des protéines

📋 Plan du Cours

1. Point isoionique et précipitation
2. Chromatographie par échange d’ions
3. Chromatographie d’affinité
4. Filtration sur gel
5. Électrophorèse SDS et réduction
6. Immunoblots analytiques
7. Chromatographie en phase inverse
8. Identification protéique

📖 1. Point isoionique et précipitation

🔑 Notions clés & Définitions

• Point isoionique : pH auquel une protéine possède autant de charges positives que de charges négatives et une charge globale nulle

★ À maîtriser

📌 La solubilité d’une protéine augmente lorsqu’elle est chargée et diminue fortement lorsque sa charge globale est nulle au pHi.

• La précipitation au pHi consiste à ajuster le pH au point isoionique d’une protéine afin de réduire sa solubilité et de la faire précipiter dans une force ionique adaptée.

Compléments

• La précipitation au pHi est principalement une méthode préparative, mais elle peut aussi être analytique pour éliminer une protéine abondante dont le pHi est connu.

💡 Astuce mémo

Charge nulle au pHi → solubilité minimale → précipitation

📖 2. Chromatographie par échange d’ions

★ À maîtriser

• En chromatographie par échange d’ions, les protéines chargées se fixent par liaisons ioniques aux billes de gel, puis sont éluées progressivement lorsque le pH modifie leur charge.

📌 Une protéine cesse de se fixer à la résine lorsque le pH atteint son pHi, car sa charge globale devient nulle.

• Un gradient progressif de pH permet d’éluer successivement les protéines selon leur pHi, les protéines au pHi le plus bas sortant d’abord lorsque le pH augmente.

Compléments

• La quantité de protéine dans les fractions peut être estimée par l’absorbance à 280 nm des résidus aromatiques, notamment le tryptophane et la tyrosine.

💡 Astuce mémo

Fixation → gradient de pH → élution au pHi

📖 3. Chromatographie d’affinité

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie d’affinité : sépare une protéine grâce à sa liaison spécifique à un ligand immobilisé sur une colonne

★ À maîtriser

• La protéine d’intérêt est retenue par le ligand immobilisé puis éluée avec une solution saturée en ligand, qui la décroche par compétition.

Compléments

• La chromatographie d’affinité peut utiliser la liaison entre une enzyme et son substrat ou entre un anticorps et un antigène.

• La chromatographie d’affinité est à la fois analytique et préparative, avec de petites colonnes pour l’étude et de grandes colonnes pouvant servir à la production industrielle.

💡 Astuce mémo

Échange d’ions : charge ; affinité : ligand spécifique

📖 4. Filtration sur gel

🔑 Notions clés & Définitions

• Filtration sur gel : sépare les molécules selon leur taille grâce à des billes poreuses qui ralentissent les petites protéines
• Volume mort : volume de tampon à purger avant l’arrivée des premières protéines exclues du gel

★ À maîtriser

📌 Les protéines trop grosses pour les pores sont exclues et sortent ensemble avec le front du solvant, tandis que les protéines plus petites pénètrent dans les billes et sont retardées.

📐 Formule — Dans le domaine d’utilisation de la colonne, il existe une relation linéaire décroissante entre le logarithme du poids moléculaire et le volume d’élution : $\log_{10}(PM) = aV_e+b$, avec une pente négative.

Compléments

• Une colonne dont la limite d’exclusion est de 100 000 Da élue ensemble, après le volume mort, toutes les protéines de masse supérieure à 100 000 Da.

💡 Astuce mémo

Grosses protéines exclues et rapides ; petites protéines ralenties

📖 5. Électrophorèse SDS et réduction

🔑 Notions clés & Définitions

• SDS : détergent qui se fixe aux protéines à raison d’une molécule pour deux acides aminés et leur apporte une charge négative proportionnelle à leur taille

★ À maîtriser

📐 Formule — En absence de gel, la mobilité électrophorétique dépend de la charge et de la masse selon $\mu = \frac{EQ}{a\,PM}$.

📌 En présence de SDS et d’un gel de polyacrylamide, les protéines sont séparées principalement selon leur poids moléculaire, les plus grosses migrant moins loin.

• Dans le SDS-PAGE, la relation entre le logarithme du poids moléculaire et la distance de migration Rf est linéaire et décroissante.

Compléments

• Le DTT ou le β-mercaptoéthanol rompt les ponts disulfure avant l’électrophorèse, ce qui sépare les sous-unités reliées par ces ponts.

💡 Astuce mémo

SDS uniformise la charge → le gel sépare selon la masse

📖 6. Immunoblots analytiques

★ À maîtriser

• Un immunoblot sépare d’abord les protéines selon leur poids moléculaire, les transfère sur un support, puis détecte la protéine recherchée avec un anticorps spécifique et une protéine marquée.

• Le Western blot est une méthode uniquement analytique qui permet de démontrer la présence d’une protéine dans un mélange sans purification préalable.

Compléments

• Pour rechercher le VIH par immunoblot, on utilise 10 anticorps différents reconnaissant chacun une protéine particulière du virus.

💡 Astuce mémo

Séparer → transférer → détecter par anticorps

📖 7. Chromatographie en phase inverse

🔑 Notions clés & Définitions

• Chromatographie en phase inverse : sépare les molécules selon leurs durées d’adsorption sur une phase stationnaire, généralement de la silice, pendant leur entraînement par une phase mobile

★ À maîtriser

📌 Une molécule qui s’adsorbe plus longtemps sur la phase stationnaire est éluée plus tard qu’une molécule qui s’y adsorbe moins longtemps.

• Les capacités d’adsorption en phase inverse ne dépendent ni de la masse ni de la charge, mais de la solubilité dans la phase mobile et des interactions avec la phase stationnaire.

Compléments

• La chromatographie en phase inverse peut être analytique ou préparative selon la taille de la colonne.

💡 Astuce mémo

Adsorption longue : élution tardive ; adsorption courte : élution précoce

📖 8. Identification protéique

🔑 Notions clés & Définitions

• Spectrométrie de masse : La spectrométrie de masse mesure le rapport masse sur charge $m/z$ d’espèces ionisées dans le vide, où la migration ne dépend pas d’une friction.

★ À maîtriser

• L’électrophorèse bidimensionnelle sépare d’abord les protéines selon leur pHi par focalisation isoélectrique, puis selon leur masse par SDS-PAGE dans une direction perpendiculaire.

📌 Lors de la focalisation isoélectrique, une protéine s’immobilise dans la zone du gel où le pH est égal à son pHi, car elle y devient globalement neutre.

• Après digestion par la trypsine, les fragments protéiques ionisés sont analysés selon leur rapport m/z puis comparés à des bases de données pour identifier la protéine.

Compléments

• La trypsine coupe les liaisons peptidiques après les résidus basiques, ce qui produit des fragments dont les rapports m/z peuvent être comparés à des bases de données.

💡 Astuce mémo

pHi → masse → fragments → base de données

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des méthodes de séparation