Fiche de révision : Microbiologie et bioproduction

📋 Plan du Cours

1. Hygiène et contamination microbienne
2. Vecteurs de contamination en bioproduction
3. Mise en évidence des micro-organismes
4. Protection assurée par le PSM
5. Catégories des milieux de culture
6. Composition et lecture des milieux
7. Souches et conditions de bioproduction
8. Dossier de lot et traçabilité
9. Fonctionnement et habilitation de l’autoclave
10. Traitements thermiques et résistance microbienne

📖 1. Hygiène et contamination microbienne

🔑 Notions clés & Définitions

• Hygiène : Ensemble de comportements individuels et collectifs visant à préserver la santé et à minimiser la transmission des maladies.
• Contamination : Présence d’éléments indésirables, notamment de micro-organismes, dans un produit, sur une surface ou dans un espace.

★ À maîtriser

📌 La flore résidente, ou microbiote, comprend des bactéries cutanées non pathogènes qui contribuent à protéger la peau contre les agressions extérieures et d’autres micro-organismes.

Compléments

• La flore transitoire peut provenir :

  • d’autres personnes
  • d’objets
  • de l’environnement
  • de l’air
  • du tube digestif

• Le corps humain, composé en moyenne à 60 % d’eau chez l’adulte, présente des nutriments et une température de 20 °C à 40 °C favorables au développement bactérien.

💡 Astuce mémo

Flore résidente protectrice, flore transitoire apportée

📖 2. Vecteurs de contamination en bioproduction

★ À maîtriser

• Les cinq vecteurs de contamination, dits 5M, sont :
  • la Main d’œuvre
  • le Milieu
  • le Matériel
  • la Matière
  • les Méthodes

Compléments

• La main-d’œuvre peut contribuer à la contamination si les employés ne respectent pas l’hygiène individuelle et ne portent pas correctement les vêtements de travail.

• Le milieu doit être conçu et clos, ventilé par de l’air filtré, facile à nettoyer et protéger les éléments nettoyés contre une recontamination.

• Le matériel doit être conçu pour être nettoyé, utilisé avec des produits de nettoyage adaptés et leurs bonnes doses, et ses rejets doivent être évacués conformément à la réglementation.

📌 Les matières et les méthodes de nettoyage doivent être appropriées, et les procédures doivent être validées par les BPF et adaptées aux besoins spécifiques.

📖 3. Mise en évidence des micro-organismes

★ À maîtriser

📌 La culture sur milieu nutritif favorise la multiplication des micro-organismes jusqu’à l’apparition de colonies visibles, tandis que l’observation microscopique permet d’observer leurs structures sur une lame.

• 🔄 La culture des micro-organismes se déroule ainsi :
  1. Ensemencer le milieu nutritif avec une anse stérile.
  2. Incuber à une température adaptée.
  3. Observer les colonies formées.

Compléments

• La température d’incubation généralement indiquée pour les bactéries humaines est de 37 °C.

• Pour observer des micro-organismes au microscope, on prélève et fixe l’échantillon sur une lame, on peut le colorer, puis on l’observe au microscope optique.

• Les grossissements indiqués sont x100 pour les bactéries, x400 pour les levures et x1000 à l’immersion pour observer des détails fins.

💡 Astuce mémo

Culture : colonies visibles ; microscopie : structures observées

📖 4. Protection assurée par le PSM

🔑 Notions clés & Définitions

• PSM : Enceinte ventilée destinée à protéger contre les agents biologiques pathogènes transmissibles par voie aérienne, mais pas contre les produits chimiques dangereux.

★ À maîtriser

• L’air sortant du PSM est filtré au minimum par des filtres absolus HEPA, aussi appelés THE, qui éliminent les particules fines de plus de 0,3 micromètre de diamètre.

📌 Dans un PSM de type I, l’air du laboratoire est aspiré par l’ouverture frontale, traverse le volume de travail puis est extrait après filtration HEPA, mais le produit manipulé n’est pas protégé.

Compléments

• Le PSM protège le manipulateur et les autres personnes présentes contre l’inhalation d’agents biologiques, et sa paroi vitrée limite les projections.

• Le PSM limite ou empêche la propagation des micro-organismes dans l’environnement, et l’air extrait peut être recyclé dans le laboratoire ou rejeté à l’extérieur.

• Le PSM protège le produit manipulé contre les micro-organismes de l’atmosphère et contre la contamination croisée provenant de produits manipulés simultanément.

📖 5. Catégories des milieux de culture

🔑 Notions clés & Définitions

• Milieu solide : Milieu contenant une concentration d’agar supérieure à 10 g · L⁻¹.
• Milieu liquide : Milieu ne contenant pas d’agar et appelé bouillon.

★ À maîtriser

📌 La composition exacte d’un milieu empirique ou complexe est inconnue, tandis que celle d’un milieu synthétique ou chimiquement défini est connue en nature et en quantité.

📌 Un milieu non sélectif permet le développement de tous les micro-organismes présents, tandis qu’un milieu sélectif limite certaines cellules grâce à un ou plusieurs inhibiteurs sans assurer une sélectivité totale.

Compléments

• Une gélose molle contient environ 5 g · L⁻¹ d’agar.

• L’agar est un polyoside extrait d’algues qui forme un gel solide sous 40 °C, se liquéfie à ébullition et reste liquide en surfusion à 45 °C.

📌 Un bouillon d’enrichissement est un milieu liquide qui favorise le germe recherché grâce à des agents sélectifs, tandis qu’un milieu d’isolement sélectif est solide et sert à isoler des bactéries d’un mélange microbien.

💡 Astuce mémo

Milieu sélectif : limite certains ; non sélectif : permet le développement de tous

📖 6. Composition et lecture des milieux

★ À maîtriser

• Dans un milieu d’identification, l’utilisation d’un glucide par une bactérie libère des déchets acides, acidifie le milieu et provoque le virage de l’indicateur coloré de pH.

• L’utilisation de peptones ou d’acides aminés par une bactérie libère des déchets basiques, alcalinise le milieu et provoque le virage de l’indicateur coloré de pH.

• La base nutritive apporte :

  • une source de carbone et d’énergie
  • une source d’azote
  • des facteurs de croissance
  • des sels minéraux

Compléments

• Les facteurs de croissance comprennent :

  • des vitamines
  • des acides aminés essentiels
  • des bases azotées

• Les sels minéraux contribuent au maintien de l’isotonie ou du pH, par exemple le chlorure de sodium pour la pression osmotique et l’hydrogénophosphate de potassium pour le pH.

• Les milieux peuvent aussi contenir de l’agar pour se solidifier, des inhibiteurs, un indicateur coloré de pH et des produits biologiques enrichissants comme le sang.

• Le sang enrichit le milieu en facteurs de croissance spécifiques, favorise la culture des Streptococcus et peut servir à tester la lyse des globules rouges par les bactéries.

💡 Astuce mémo

Utilisation d’un glucide → acidification → virage de l’indicateur

📖 7. Souches et conditions de bioproduction

★ À maîtriser

• Escherichia coli porte un plasmide permettant la production d’une protéine fluorescente appelée GFP.

• Lactobacillus casei est utilisée pour produire de l’acide lactique pouvant être utilisé en cosmétique.

• Saccharomyces cerevisiae est une levure productrice de l’enzyme invertase.

• Les paramètres de culture à contrôler comprennent :

  • la température
  • le pH
  • la concentration en oxygène
  • la composition du milieu
  • l’agitation

Compléments

• La vérification des conditions de culture porte sur le pH, la température, la concentration en NaCl et l’atmosphère de croissance.

📖 8. Dossier de lot et traçabilité

🔑 Notions clés & Définitions

• Dossier de lot : Le dossier de lot rassemble les informations relatives à la production et au contrôle d’un lot afin d’en assurer la traçabilité et la qualité.

★ À maîtriser

📌 Les enregistrements de lot doivent porter un numéro de lot ou un identifiant unique, être datés et signés lors de leur émission. - ANSM, Guide des bonnes pratiques de fabrication, décembre 2022

• L’enregistrement des étapes significatives comprend les dates et horaires éventuels, les équipements, les identifiants et quantités des matières, les paramètres critiques, les échantillonnages, les signatures, les résultats de contrôles, les rendements, les informations de conditionnement, les écarts et les résultats de libération. - ANSM, Guide des bonnes pratiques de fabrication, décembre 2022

Compléments

📌 Chaque dossier de production de lot doit être vérifié avant émission afin de confirmer qu’il s’agit de la bonne version et d’une reproduction fidèle et lisible des instructions appropriées. - ANSM, Guide des bonnes pratiques de fabrication, décembre 2022

📖 9. Fonctionnement et habilitation de l’autoclave

🔑 Notions clés & Définitions

• Autoclave : Enceinte métallique hermétiquement close qui permet de stériliser ou de pasteuriser par chaleur humide.
• Habilitation autoclave : Attestation de formation obtenue après la formation correspondante et obligatoire pour les salariés concernés par la conduite ou la maintenance de ces équipements.

★ À maîtriser

• Dans l’autoclave, on chauffe de l’eau sous pression jusqu’à saturation en vapeur, la vapeur purge l’air, la valve d’éjection se ferme, le traitement thermique est maintenu selon le barème, puis le refroidissement et le séchage précèdent le retour à la pression atmosphérique.

• Le barème général de stérilisation indiqué est de 121 °C maintenus pendant 15 à 20 min en autoclave.

Compléments

• La durée de validité de l’habilitation à la conduite d’autoclave est de 3 ans.

• Les risques liés à l’autoclave comprennent l’explosion avec projection d’éclats et les brûlures provoquées par l’ouverture intempestive du récipient.

💡 Astuce mémo

Purger l’air, atteindre la température, maintenir le barème, refroidir et sécher

📖 10. Traitements thermiques et résistance microbienne

★ À maîtriser

📌 La stérilisation tend à éliminer ou tuer tous les micro-organismes et à inactiver les virus, tandis que la pasteurisation chauffe un aliment entre 60 °C et 100 °C pendant un temps défini avant son refroidissement rapide.

📌 La chaleur humide dénature les protéines et inactive les micro-organismes, tandis que la chaleur sèche carbonise les matières organiques et entraîne leur mort.

• Les spores bactériennes sont extrêmement résistantes à la chaleur et peuvent résister à une température supérieure à 100 °C pendant plusieurs dizaines de minutes.

Compléments

• Le niveau d’assurance de stérilité indiqué est de 10⁻⁶ en secteur pharmaceutique et de 10⁻³ en secteur agro-alimentaire.

• En milieu aqueux, les formes végétatives sont tuées à 50–60 °C pendant 30 minutes, tandis qu’elles résistent davantage en milieu déshydraté.

• Un chauffage de 10 minutes à 80 °C peut sélectionner les spores en tuant les formes végétatives les moins résistantes.

• Les indicateurs biologiques contenant des spores de Bacillus stearothermophilus permettent de vérifier l’efficacité de l’autoclavage, mais ce test de stérilité est facultatif.

• Le four poupinel est une étuve à chaleur sèche utilisée au laboratoire pour stériliser des tubes à hémolyse bouchés avec du coton cardé à 140 °C pendant 3 h.

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des milieux de culture

Comparaison des traitements thermiques