QCM : Phage display et techniques de sélection (31 questions)

Explication

Le phage display expose des peptides ou des protéines à la surface d’un phage filamenteux. La culture d’expression produit des protéines en bactérie, la transfection introduit du matériel génétique dans des cellules et l’hybridation détecte des séquences complémentaires.

Explication

La construction repose sur l’insertion dans le génome phagique de la séquence codant la protéine d’intérêt, fusionnée à celle d’une protéine de surface. Une séquence non fusionnée ou associée à une protéine interne ne correspond pas à cette stratégie, et une protéine mature ne s’ajoute pas directement au génome.

Explication

Le phénotype correspond à la protéine présentée à la surface, tandis que le génotype est la séquence qui la code dans le génome phagique. L’inversion attribue ces termes à l’envers, et la cible n’est ni le génotype ni le phénotype.

Explication

Le phage display vise à sélectionner les phages dont le peptide ou la protéine présenté interagit avec la cible choisie. La liaison directe du génome et la vitesse de multiplication ne définissent pas cet objectif, tandis qu’une absence d’interaction va à son encontre.

Explication

Un bactériophage infecte des bactéries et dépend d’une bactérie hôte pour se multiplier. Un virus autonome n’a pas cette dépendance, un virus animal est associé à un autre type d’hôte, et la présence d’ARN décrit le matériel génétique plutôt que l’hôte.

Explication

M13 est filamenteux et quitte la bactérie sans la tuer, alors que le phage λ est lytique et provoque sa lyse. L’inversion des comportements attribue à chaque phage celui de l’autre, et les deux propositions uniformes effacent cette distinction.

Explication

Le génome de M13 est un ADN circulaire simple brin positif de 6,4 kb qui comprend 10 gènes numérotés de I à X. Les autres profils modifient respectivement le nombre de brins, la polarité ou la forme du génome.

Explication

Le cycle comporte l’entrée, la multiplication, puis l’assemblage et la sortie des nouveaux phages. Placer l’assemblage avant la multiplication inverse les étapes, l’omission de l’entrée laisse de côté le début du cycle, et la sortie avant l’assemblage inverse les deux étapes finales.

Explication

PIII se fixe au pilus sexuel des bactéries F+, ce qui permet au phage d’attacher et d’injecter son ADN simple brin positif. PIV correspond au pore de sortie, PII intervient dans la réplication, et le génome injecté n’est pas un brin négatif double brin.

Explication

Les enzymes bactériennes synthétisent un brin négatif complémentaire au brin positif injecté, formant ainsi un ADN double brin. Le génome injecté est simple brin, et les deux brins de la forme réplicative ne sont ni tous deux négatifs ni tous deux positifs.

Explication

PII coupe le brin positif et produit une extrémité 3’OH servant d’amorce, tandis que le brin négatif guide la synthèse des nouveaux brins positifs. Couper le brin négatif ou utiliser le brin positif comme matrice confond les rôles des brins; une extrémité 5’ ne remplace pas l’amorce 3’OH.

Explication

Les protéines de capside utilisées pour l’affichage sont PIII et PVIII. PII et PV participent à la réplication, PI et PIV à l’assemblage, tandis que PVII et PIX sont situées à l’autre extrémité du phage.

Explication

PIII comprend 406 acides aminés, existe en 3 à 5 copies par phage et se trouve à l’extrémité, ce qui en fait une protéine d’affichage fréquemment utilisée. Les 2 700 copies et les 50 acides aminés caractérisent PVIII; le nombre de copies ne doit pas être confondu avec la longueur de la protéine.

Explication

PVIII ne comprend que 50 acides aminés, mais elle est présente en 2 700 copies par phage et permet ainsi un affichage en grand nombre. PIII est plus longue et présente en quelques copies; les deux autres propositions attribuent à PVIII des caractéristiques de PIII.

Explication

Un phage est homogène, ou polyvalent, lorsque toutes ses protéines PIII ou PVIII sont fusionnées au peptide présenté. Le terme hétérogène désigne une fusion partielle, et monovalent correspond à cette présentation partielle plutôt qu’à la fusion de toutes les copies.

Explication

Une banque de peptides est construite en clonant des oligonucléotides synthétiques aléatoires, par exemple de type NNK, dans le génome phagique et en les fusionnant à pIII ou pVIII. Les séquences VH et VL concernent les banques d’anticorps, l’absence de fusion empêche la présentation attendue, et le génome bactérien n’est pas le vecteur indiqué.

Explication

Chaque position peut contenir l’un des 20 acides aminés, donc le nombre de séquences est $20^4 = 160\,000$. Le calcul $20 \times 4$ traite à tort les positions de façon additive, $\binom{20}{4}$ ignore l’ordre, et $4^4$ inverse le nombre de positions et celui des choix.

Explication

Le Fab recombinant pèse environ 60 kDa et comprend les domaines VH-CH1 et VL-CL. Le ScFv est plus petit, environ 30 kDa, et ne comprend que VH et VL; omettre CL ou attribuer les domaines constants au ScFv confond les architectures.

Explication

Les banques immunisées proviennent de donneurs exposés à un antigène; elles sont plus petites et contiennent des anticorps de plus haute affinité. Le profil des banques naïves correspond à des donneurs non immunisés et à une plus grande diversité, tandis que l’affinité faible à moyenne est attribuée à ces banques naïves.

Explication

Le biopanning comprend le contact avec la cible immobilisée, le lavage des phages non liés, l’élution des phages retenus et leur réamplification bactérienne. Réamplifier avant le lavage, éluer les non-liés ou omettre la réamplification ne respecte pas cette succession.

Explication

Les phages sont d’abord individualisés par infection bactérienne; l’ADN phagique de chaque clone est ensuite extrait afin de séquencer la région codant le peptide ou le fragment d’anticorps présenté. Séquencer la banque en amont, analyser l’ADN de la cible ou conserver un mélange empêche d’associer chaque séquence à un clone distinct.

Explication

Une fixation non spécifique aux surfaces peut faire paraître positif un phage qui ne reconnaît pas la cible: elle produit donc un faux positif et justifie une caractérisation. La confondre avec une liaison spécifique, avec un faux négatif ou avec une preuve issue de l’enrichissement attribue à tort une spécificité au signal.

Explication

Si la liaison entre le peptide présenté et l’anticorps est spécifique, l’antigène libre doit concurrencer le peptide et le déplacer. L’absence de déplacement indique un faux positif; une augmentation de la fixation ou un détachement du phage sans compétition ne démontre pas cette spécificité.

Explication

Le ribosome display et le mRNA display sont des systèmes entièrement in vitro qui ne reposent pas sur un phage. L’idée d’un phage auxiliaire confond ces méthodes avec le phage display, tandis que les deux autres réponses attribuent à tort une dépendance au phage ou aux cellules.

Explication

Le remplacement du codon stop par SecM stabilise le complexe ARNm-ribosome-protéine en empêchant la dissociation du ribosome. La dissociation, l’attachement de la puromycine et le déport de la protéine correspondent à des fonctions attribuées à tort à SecM.

Explication

Les complexes retenus sont élués, puis leur ARNm est récupéré, rétrotranscrit et amplifié par RT-PCR avant le séquençage. Séquencer avant la récupération inverse l’ordre, la traduction remplace à tort la rétrotranscription et l’amplification porte sur l’ARNm, non sur la protéine.

Explication

À la jonction ARN-ADN, la puromycine portée par le linker entre dans le site A et se lie à la protéine nouvellement synthétisée. SecM stabilise le complexe en ribosome display, tandis que le site P et le peptide non structuré ne décrivent pas ce mécanisme.

Explication

Une séquence identique ou très proche de celle de l’antigène caractérise un épitope continu. Un mimotope se distingue par l’absence d’homologie de séquence, et les deux autres réponses ne désignent pas la catégorie définie par cette similitude.

Explication

Un mimotope n’a pas d’homologie de séquence avec l’antigène, mais peut être reconnu parce qu’il mime l’épitope; il constitue un équivalent linéaire d’un épitope conformationnel. L’épitope continu implique une séquence identique ou proche, et l’absence d’homologie n’empêche pas la liaison.

Explication

La sélection se fait à partir d’un antigène choisi et retient les phages dont le fragment d’anticorps le reconnaît. Présenter l’antigène inverse le dispositif, la liaison à un récepteur relève d’un autre objectif et produire l’antigène ne correspond pas au critère de sélection.

Explication

Une banque construite à partir de donneurs humains permet de sélectionner des anticorps monoclonaux entièrement humains, présentant un intérêt thérapeutique, notamment en cancérologie. Les hybridomes de souris relèvent de l’immunisation animale, l’origine murine contredit celle de la banque et la sélection vise des anticorps monoclonaux, non polyclonaux.