Fiche de révision : Phage display et techniques de sélection

📋 Plan du Cours

1. Principe et lien génotype-phénotype
2. Phages et morphologie de M13
3. Cycle infectieux du phage M13
4. Présentation par les protéines de capside
5. Construction des banques et clonage
6. Sélection et caractérisation des phages
7. Ribosome display et mRNA display
8. Applications des banques de peptides
9. Applications des banques d’anticorps

📖 1. Principe et lien génotype-phénotype

🔑 Notions clés & Définitions

• Phage display : Technique qui présente des peptides ou des protéines à la surface d’un phage filamenteux.

★ À maîtriser

• La construction d’un phage display consiste à insérer dans le génome du phage la séquence codant le peptide ou la protéine d’intérêt, fusionnée à la séquence d’une protéine de surface.

📌 Dans le phage display, le phénotype est la protéine présentée à la surface du phage, tandis que le génotype est la séquence qui la code dans le génome phagique.

• L’objectif du phage display est de sélectionner les phages dont le peptide ou la protéine présenté interagit avec une cible choisie.

Compléments

• George Smith a mis au point le phage display en 1985.

• Lors de la multiplication du phage, la protéine de fusion est exprimée et incorporée dans les nouveaux phages.

• Une banque de phages peut atteindre une diversité de l’ordre de 10^10, chaque phage présentant un seul type de peptide ou de protéine.

💡 Astuce mémo

Fusion gène-protéine de surface → le phage affiche le peptide tout en en conservant le code génétique.

📖 2. Phages et morphologie de M13

🔑 Notions clés & Définitions

• Bactériophage : Virus qui infecte uniquement des bactéries et ne peut se multiplier qu’en infectant une bactérie hôte.

★ À maîtriser

📌 Le phage M13 est filamenteux et sort de la bactérie sans la tuer, tandis que le phage λ est lytique et provoque sa lyse.

• Le génome de M13 est un ADN circulaire simple brin positif de 6,4 kb qui contient 10 gènes numérotés de I à X.

Compléments

• Le phage display utilise des phages qui infectent des bactéries Gram négatif, notamment Escherichia coli.

• Le phage M13 est utilisé dans 90 % des applications du phage display.

• Le phage M13 mesure 900 nm de longueur et 6 nm de diamètre.

• Les gènes de M13 codent trois catégories de protéines :
  • cinq protéines de capside : PIII, PVI, PVII, PVIII et PIX
  • trois protéines de réplication : PII, PV et PX
  • deux protéines d’assemblage : PI et PIV

💡 Astuce mémo

M13 sort sans lyse ; λ sort en lysant la bactérie.

📖 3. Cycle infectieux du phage M13

★ À maîtriser

• 🔄 Le cycle infectieux de M13 comprend trois étapes :

  1. entrée dans la bactérie
  2. multiplication du phage
  3. assemblage et sortie des nouveaux phages

• M13 infecte les bactéries mâles F+ : sa protéine PIII se fixe au pilus sexuel, puis le phage injecte son ADN simple brin positif dans le cytoplasme.

• Les enzymes bactériennes convertissent le brin positif injecté en ADN double brin, appelé forme réplicative, composé d’un brin positif et d’un brin négatif complémentaire.

• 🔄 La réplication en cercle roulant se déroule ainsi : PII coupe le brin positif et libère une extrémité 3’OH, l’extrémité 3’OH sert d’amorce à la synthèse d’un nouveau brin positif à partir du brin négatif, PII circularise les nouveaux brins positifs

• 🔄 L’assemblage et la sortie de M13 suivent ces étapes : le peptide signal dirige les protéines de capside vers la membrane bactérienne, les protéines de capside s’assemblent autour du brin positif dans la région sous-membranaire, le phage sort par le pore PIV

Compléments

• Une bactérie peut contenir jusqu’à 100 à 200 copies de la forme réplicative de M13.

• Lorsque PV est suffisamment abondante, elle se lie aux brins positifs simples et empêche leur conversion en forme réplicative, les orientant vers l’assemblage.

• Dans le modèle décrit, un seul phage infecte une bactérie.

💡 Astuce mémo

Entrée du brin + → réplication en cercle roulant → assemblage et sortie.

📖 4. Présentation par les protéines de capside

★ À maîtriser

• Les protéines de capside utilisées pour présenter un peptide ou une protéine dans le phage display sont PIII ou PVIII.

• PIII comprend 406 acides aminés et est présente en 3 à 5 copies par phage ; sa localisation à l’extrémité en fait la protéine la plus utilisée pour le phage display.

• PVIII comprend 50 acides aminés et est présente en 2 700 copies par phage, ce qui permet d’afficher de nombreuses copies d’un peptide.

📌 Un phage homogène, ou polyvalent, fusionne toutes ses protéines PIII ou PVIII avec le peptide ou la protéine présenté, tandis qu’un phage hétérogène, ou monovalent, n’en fusionne qu’une partie.

Compléments

• Le faible nombre de copies de PIII limite l’avidité et favorise la sélection de ligands à forte affinité.

• Une grosse protéine ne peut généralement pas être fusionnée à PIII, car la fusion risque d’interférer avec l’infection bactérienne.

• Le grand nombre de copies de PVIII augmente l’avidité et peut conduire à sélectionner des ligands de plus faible affinité que la faible valence de PIII.

💡 Astuce mémo

PIII, peu de copies et faible avidité ; PVIII, nombreuses copies et avidité accrue.

📖 5. Construction des banques et clonage

🔑 Notions clés & Définitions

• Codon NNK : Codon aléatoire où N représente l’un des quatre nucléotides et K représente G ou T ; il limite l’apparition de codons stop et la surreprésentation de certains acides aminés.
• Phagemide : Vecteur hybride artificiel entre un plasmide et un phage M13 ; il possède deux origines de réplication, plasmidique et phagique, mais ne contient pas toutes les séquences nécessaires à la formation de sa capside et à la réplication de son acide nucléique.

★ À maîtriser

• Une banque de peptides se construit en clonant dans le génome phagique des oligonucléotides synthétiques aléatoires, par exemple de type NNK, fusionnés à pIII ou pVIII.

• Avec 20 acides aminés possibles, le nombre de séquences d’un peptide de longueur n est $20^n$.

• Les ScFv, d’environ 30 kDa, comprennent les domaines VH et VL, tandis que les Fab recombinants, d’environ 60 kDa, comprennent les domaines VH-CH1 et VL-CL.

• Les banques naïves proviennent de donneurs non immunisés et sont grandes mais contiennent des anticorps de faible à moyenne affinité, tandis que les banques immunisées proviennent de donneurs exposés à un antigène et sont plus petites mais contiennent des anticorps de plus haute affinité.

• Le phage display polyvalent utilise l’ADN de M13 modifié pour exprimer la protéine de capside fusionnée, tandis que le phage display monovalent utilise un phagemide associé à un phage auxiliaire fournissant les protéines de capside sauvages.

Compléments

📌 La longueur des peptides présentés est libre avec PIII, mais elle est limitée avec PVIII pour éviter l’encombrement stérique.

📌 Les peptides présentés peuvent être linéaires ou contraints, ces derniers comportant des cystéines qui établissent des ponts disulfure.

• Pour construire une banque d’anticorps, les lymphocytes B de donneurs sont isolés après prélèvement sanguin, leurs séquences VH et VL sont amplifiées par PCR puis clonées dans le génome du phage.

📌 Pour cloner une banque dans pIII ou pVIII, la séquence d’intérêt est insérée en 5’ de la séquence codant la protéine de capside, entre le peptide signal et cette séquence codante.

📖 6. Sélection et caractérisation des phages

★ À maîtriser

• 🔄 Le biopanning suit ces étapes : mettre la banque de phages en contact avec une cible immobilisée, laver pour éliminer les phages non liés, éluer les phages retenus, réamplifier les phages dans des bactéries

• Après la sélection, les phages sont individualisés par infection bactérienne, l’ADN phagique de chaque clone est extrait et la région codant le peptide ou le fragment d’anticorps présenté est séquencée.

• Les phages peuvent se fixer non spécifiquement aux surfaces et produire des faux positifs, ce qui rend nécessaire la caractérisation des phages sélectionnés.

• Dans un test d’inhibition, l’antigène libre doit déplacer le peptide présenté par le phage si sa liaison à l’anticorps est spécifique ; l’absence de déplacement indique un faux positif.

Compléments

• Pour identifier l’épitope reconnu par un anticorps, on peut immobiliser cet anticorps et sélectionner les phages d’une banque de peptides qui s’y lient.

• La sélection comporte généralement 3 à 4 tours afin d’enrichir la population en phages positifs.

• Dans un test ELISA, l’anticorps cible immobilisé est incubé avec le phage isolé, puis l’interaction est révélée par un anticorps anti-M13 couplé à une peroxydase.

💡 Astuce mémo

Fixer la cible → laver → éluer → réamplifier → vérifier.

📖 7. Ribosome display et mRNA display

★ À maîtriser

📌 Le ribosome display et le mRNA display sont des systèmes de présentation entièrement in vitro qui ne reposent pas sur un phage.

• Le ribosome display maintient un complexe ternaire ARNm-ribosome-protéine nouvellement synthétisée, notamment en supprimant le codon stop et en le remplaçant par une séquence SecM qui empêche la dissociation du ribosome.

• En ribosome display, les complexes liés à la cible immobilisée sur une bille sont élués, puis leur ARNm est récupéré, rétrotranscrit par RT-PCR et séquencé.

• Dans le mRNA display, un ADN linker portant une puromycine est ajouté à l’extrémité 3’ de l’ARNm ; à la jonction ARN-ADN, la puromycine entre dans le site A du ribosome et se lie à la protéine nouvellement synthétisée.

• En mRNA display, les complexes liés à la cible immobilisée sur une bille sont élués, puis leur ARNm est récupéré, amplifié par RT-PCR et séquencé pour identifier la protéine présentée.

Compléments

• Dans le ribosome display, une séquence linker code un peptide non structuré qui déporte la protéine nouvellement synthétisée à l’extérieur du ribosome pour la rendre accessible à un partenaire d’interaction.

• En ribosome display, une banque d’ADN est transcrite in vitro en ARNm, puis traduite in vitro dans un lysat cellulaire contenant des ribosomes.

• Le mRNA display forme un complexe entre l’ARNm, l’ADN linker, la puromycine et la protéine nouvellement synthétisée, sans ribosome dans le complexe sélectionné.

💡 Astuce mémo

Ribosome display retient le complexe par SecM ; mRNA display relie la protéine à l’ARNm par la puromycine.

📖 8. Applications des banques de peptides

🔑 Notions clés & Définitions

• Mimotope : Peptide sans homologie de séquence avec l’antigène ayant induit l’anticorps, mais auquel cet anticorps peut se lier parce qu’il mime l’épitope ; il correspond à un équivalent linéaire d’un épitope conformationnel.

★ À maîtriser

📌 Un peptide identifié dont la séquence est identique ou très proche de celle de l’antigène ayant induit l’anticorps correspond à un épitope continu.

Compléments

• Les banques de peptides peuvent être sélectionnées contre : un anticorps, une protéine dont on recherche les partenaires d’interaction, de l’ADN, une cellule entière, un sérum de patients atteints de maladies

💡 Astuce mémo

Séquence proche de l’antigène : épitope continu ; séquence différente : mimotope.

📖 9. Applications des banques d’anticorps

★ À maîtriser

📌 Une banque de phages d’anticorps permet de sélectionner, contre un antigène choisi, les phages présentant un fragment d’anticorps capable de le reconnaître.

Compléments

• Le phage display utilisant des banques d’anticorps constitue une alternative à l’immunisation animale, notamment à la technique des hybridomes de souris, pour obtenir des anticorps monoclonaux.

• Une banque construite à partir de donneurs humains permet de sélectionner des anticorps monoclonaux entièrement humains, présentant un intérêt thérapeutique notamment en cancérologie et dans les maladies inflammatoires chroniques.

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des protéines de présentation