Fiche de révision : Propriétés et manipulation de l’ADN

📋 Plan du Cours

1. Spectrophotométrie des acides nucléiques
2. Dénaturation et hybridation de l’ADN
3. PCR et détection des mutations
4. Électrophorèse sur gel d’agarose
5. Enzymes de restriction et clonage
6. Cartes de restriction et Southern blot
7. Séquençage de Sanger

📖 1. Spectrophotométrie des acides nucléiques

🔑 Notions clés & Définitions

• Température de fusion : Température à laquelle 50 % des molécules sont sous forme double brin.
• Effet hyperchrome : Augmentation de l’absorption de la lumière ultraviolette par l’ADN lors de sa dénaturation.

★ À maîtriser

• Les acides nucléiques et les protéines peuvent être quantifiés par spectrophotométrie en mesurant leur absorbance à 260 nm.

📐 Formule - La loi de Beer-Lambert s’écrit $A = \varepsilon \cdot l \cdot c$, où A est l’absorbance, ε le coefficient d’extinction molaire, l le trajet optique et c la concentration.

• À 260 nm, 1 DO correspond à 50 μg/mL pour les acides nucléiques double brin et à 37 μg/mL pour les acides nucléiques simple brin.

Compléments

• Pour une cuve standard, le trajet optique l vaut 1 cm.

• Un ADN pur présente un ratio A260/A280 compris entre 1,8 et 2,0, utilisé pour évaluer une contamination par les protéines.

📖 2. Dénaturation et hybridation de l’ADN

★ À maîtriser

• La dénaturation et la renaturation de l’ADN sont réversibles, propriété utilisée notamment en PCR et en Southern et Northern blot.

• Une forte concentration en sel favorise l’hybridation de l’ADN en réduisant la répulsion électrostatique entre les deux brins.

• La vitesse de renaturation d’une séquence d’ADN est directement proportionnelle à sa fréquence de répétition dans le génome, comme l’ont étudié Britten, Kohne et Davidson dans les années 1960.

Compléments

• L’hybridation de l’ADN est optimale à pH neutre, entre pH 6 et 8.

• La vitesse de renaturation augmente avec la concentration des brins d’ADN et le temps disponible.

• Une séquence fortement répétée renature plus rapidement qu’une séquence simple copie et nécessite une valeur de C0t1/2 plus faible.

• Les autres facteurs d’hybridation sont :

  • la température
  • le pourcentage de G+C
  • la complexité du génome
  • le taux de mésappariement

📌 L’ARN est plus stable thermiquement que l’ADN, ses structures secondaires se déplient progressivement et sa renaturation est plus rapide car elle est intramoléculaire.

💡 Astuce mémo

Le sel réduit la répulsion électrostatique → l’hybridation est favorisée

📖 3. PCR et détection des mutations

★ À maîtriser

• La PCR amplifie in vitro une séquence ciblée d’ADN par 30 à 40 cycles thermiques comprenant une dénaturation, l’hybridation des amorces et une extension.

Compléments

📌 La température d’hybridation en PCR doit être ajustée au degré près selon la Tm des amorces afin de garantir la spécificité de la réaction.

• Lors d’une détection par réhybridation, une mutation peut empêcher la sonde de se réhybrider de façon stable, entraînant une faible rétention du signal et permettant d’identifier l’individu porteur.

💡 Astuce mémo

Dénaturation → hybridation des amorces → extension

📖 4. Électrophorèse sur gel d’agarose

🔑 Notions clés & Définitions

• Électrophorèse sur gel d’agarose : Technique de séparation de molécules selon leur charge, leur taille et leur forme dans un gel.
• Gel d’agarose : Polysaccharide polymère non ramifié, à base d’agar-agar purifié, dont le maillage dépend de la concentration en agarose.
• Tampon de migration : Solution saline conductrice qui guide le déplacement des molécules sous l’action d’un champ électrique.

★ À maîtriser

• L’ADN migre vers l’anode sous l’effet d’un champ électrique, avec une tension de 5 à 10 V par cm de gel.

• L’électrophorèse sur gel d’agarose sert à : estimer la taille de fragments d’ADN après digestion par des enzymes de restriction, analyser l’ADN ou l’ARN après une amplification par PCR, séparer les fragments d’ADN digérés avant un Southern blot, séparer l’ARN avant un Northern blot

Compléments

• Un marqueur moléculaire est un mélange de fragments de tailles connues qui sert de repère pour estimer la taille des fragments de l’échantillon.

• L’intensité des bandes observées est proportionnelle à la quantité d’ADN présente dans l’échantillon.

• Les bandes d’acides nucléiques sont visualisées sous lumière UV ou par émission de fluorescence, selon l’agent intercalant utilisé.

💡 Astuce mémo

Un gel d’agarose agit comme un tamis : les fragments courts migrent plus loin

📖 5. Enzymes de restriction et clonage

🔑 Notions clés & Définitions

• Enzyme de restriction : Enzyme qui reconnaît une séquence nucléotidique très précise, presque toujours palindromique, qui se lit à l’identique dans le sens 5′ → 3′ sur les deux brins.
• ADN ligase : Enzyme qui reforme les liaisons phosphodiester du squelette de l’ADN.

★ À maîtriser

• Les bactéries produisent des endonucléases capables de couper l’ADN viral, tandis que des groupements méthyle protègent leurs propres sites de reconnaissance contre la coupure.

📌 EcoRI produit des bords cohésifs dont les surplombs peuvent s’apparier par complémentarité, tandis que SmaI produit des bords francs plus difficiles à ligaturer ultérieurement.

Compléments

• Pour cloner un gène, le vecteur et le gène d’intérêt sont digérés avec la même enzyme afin d’obtenir des extrémités compatibles, puis leurs fragments sont ligaturés et le résultat est vérifié par électrophorèse.

💡 Astuce mémo

EcoRI laisse des bords cohésifs, tandis que SmaI produit des bords francs

📖 6. Cartes de restriction et Southern blot

🔑 Notions clés & Définitions

• Southern blot : Technique qui détecte un fragment d’ADN spécifique au sein d’un mélange complexe à l’aide d’une sonde radioactive ou fluorescente complémentaire.

★ À maîtriser

• Dans le dépistage de la drépanocytose par Southern blot, la mutation T>A détruit un site de coupure reconnu par l’enzyme de restriction MstII.

📌 L’allèle normal HbA est coupé par MstII en un fragment de 1,1 kb, tandis que l’allèle muté HbS n’est pas coupé et produit un fragment de 1,35 kb.

Compléments

• Une carte de restriction est établie en comparant les tailles des fragments obtenus après digestion simple et double sur un gel afin de localiser les sites de coupure sur l’ADN.

• Le Southern blot du dépistage de la drépanocytose comprend l’extraction et la digestion de l’ADN, sa séparation par électrophorèse, son transfert sur membrane, l’hybridation avec une sonde marquée et la lecture du signal.

📖 7. Séquençage de Sanger

📝 Points essentiels

• Le séquençage de Sanger permet de lire une séquence d’ADN base par base.

📊 Tableaux de synthèse

Comparaison des allèles de la β-globine