Fiche de révision : Microscopie et marquage cellulaire

📋 Plan du Cours

1. Résolution et principes de microscopie
2. Microscopie optique à transmission
3. Microscopie à fluorescence
4. Préparation des échantillons
5. Coloration et contraste cellulaire
6. Marquage immunocytochimique
7. Marquages direct et indirect

📖 1. Résolution et principes de microscopie

🔑 Notions clés & Définitions

• Limite de séparation : La plus petite distance à laquelle deux objets distincts restent discernables.

★ À maîtriser

• L’œil nu distingue les objets jusqu’à 100 µm, tandis que la microscopie optique atteint une résolution de 200 nm, soit 500 fois meilleure.

Compléments

• La lumière utilisée en microscopie optique est relativement peu destructrice, ce qui permet d’observer des cellules vivantes en culture dans certaines conditions.

• La microscopie optique a une résolution plus faible que la microscopie électronique.

💡 Astuce mémo

Œil nu : 100 µm ; microscope optique : 200 nm

📖 2. Microscopie optique à transmission

★ À maîtriser

• En microscopie à transmission, la lumière traverse les cellules, qui peuvent être vivantes et non colorées ou fixées et colorées.

• 🔄 La lumière suit le trajet suivant :

  1. La source envoie des photons au condenseur.
  2. Le condenseur focalise les photons sur l’objet.
  3. L’objectif récupère les rayons.
  4. Les rayons sont envoyés vers l’oculaire placé au contact de l’œil.

Compléments

• La microscopie à transmission permet notamment de suivre des cultures cellulaires directement dans leur récipient de culture.

💡 Astuce mémo

Source → condenseur → objet → objectif → oculaire

📖 3. Microscopie à fluorescence

🔑 Notions clés & Définitions

• Fluorochrome : Une molécule qui absorbe des photons à une longueur d’onde d’excitation spécifique, passe de l’état fondamental à un état excité, puis émet des photons en revenant à l’état fondamental.

★ À maîtriser

📌 La longueur d’onde d’excitation d’un fluorochrome est toujours plus faible que sa longueur d’onde d’émission.

• 🔄 Le signal fluorescent est sélectionné en plusieurs étapes :
  1. La source émet plusieurs longueurs d’onde.
  2. Un premier filtre sélectionne la longueur d’onde d’excitation.
  3. Les photons éclairent l’objet.
  4. Les fluorochromes émettent des photons à une longueur d’onde supérieure.
  5. L’objectif et un second filtre sélectionnent la longueur d’onde d’émission à observer.

Compléments

• La microscopie à fluorescence permet de détecter une faible quantité de molécules fluorescentes grâce à sa grande sensibilité.

• Les fluorochromes sont liposolubles et hydrophobes, ce qui leur permet de traverser les membranes.

• Le DAPI marque le noyau, le LysoTracker les lysosomes et le MitoTracker les mitochondries.

💡 Astuce mémo

Excitation plus courte, émission plus longue

📖 4. Préparation des échantillons

★ À maîtriser

• La préparation classique comprend cinq étapes :

  • Fixation
  • Déshydratation
  • Inclusion
  • Coupe
  • Obtention du contraste

• La fixation tue les cellules tout en maintenant leurs constituants en place afin de conserver l’organisation de la préparation.

• En microscopie optique, les coupes ont une épaisseur de 1 à 10 µm afin de laisser passer les faisceaux lumineux à travers la préparation.

Compléments

• La préparation d’échantillons est fréquente pour les tissus trop épais et n’est pas obligatoire pour observer des cellules vivantes non colorées.

• Le formaldéhyde et le glutaraldéhyde sont des exemples de fixateurs appartenant aux aldéhydes.

• La déshydratation prépare l’inclusion, facilite la miscibilité avec le matériau d’inclusion et évite des déformations lorsque le vide est nécessaire en microscopie électronique.

• La déshydratation est réalisée par des bains d’alcool à concentrations croissantes.

• L’inclusion rend l’échantillon suffisamment solide pour résister à la coupe, notamment lorsqu’il s’agit de tissus fragiles, et peut utiliser de la paraffine.

• 🔄 La coupe au microtome se déroule ainsi :
  1. L’échantillon fixé est placé sur le bras du microtome.
  2. Chaque tour de roue fait avancer l’appareil de l’épaisseur choisie.
  3. Le microtome descend une coupe sur la lame.
  4. Plusieurs tours forment un ruban de coupes disposé sur une lame de verre.

💡 Astuce mémo

Fixer → déshydrater → inclure → couper → contraster

📖 5. Coloration et contraste cellulaire

★ À maîtriser

• La coloration n’est pas toujours nécessaire en microscopie optique, car la réfringence naturelle des cellules peut fournir du contraste, notamment dans des cultures de cellules vivantes comme une culture primaire de neurones de rat.

📌 Les colorants basiques colorent les structures acides, tandis que les colorants acides colorent les structures basiques.

• Lors de l’apoptose, la phosphatidylsérine normalement située principalement sur le feuillet interne de la membrane plasmique est présente sur le feuillet externe et peut être détectée par l’annexine V-FITC verte.

• L’iodure de propidium, chargé et rouge, ne traverse pas les membranes intactes et se lie à l’ADN des cellules ayant perdu leur intégrité membranaire, souvent nécrotiques.

Compléments

• L’hématoxyline est un colorant basique qui colore le noyau en violet, notamment les acides nucléiques.

• L’éosine est un colorant acide qui colore le cytoplasme en rose, notamment ses protéines basiques.

• L’annexine V couplée au FITC est une protéine chargée qui ne traverse pas les membranes et possède une forte affinité pour la phosphatidylsérine (PS).

💡 Astuce mémo

Colorant basique → structure acide ; colorant acide → structure basique

📖 6. Marquage immunocytochimique

🔑 Notions clés & Définitions

• Immunocytochimie : Utilise un anticorps couplé à une molécule détectable, comme un colorant ou un fluorochrome, afin de marquer spécifiquement une protéine d’intérêt dans des cellules ou des tissus.

★ À maîtriser

📌 L’immunocytochimie identifie spécifiquement des protéines, tandis que les agents de contraste identifient globalement des structures sans spécificité moléculaire.

Compléments

• Le FITC et le TRITC sont des exemples de fluorochromes utilisables en immunocytochimie.

💡 Astuce mémo

Marquage spécifique des protéines, contrairement au contraste global

📖 7. Marquages direct et indirect

★ À maîtriser

• En marquage direct, un anticorps dirigé contre un antigène est directement couplé à une molécule détectable.

• En marquage indirect, un anticorps primaire se fixe à l’antigène, puis plusieurs anticorps secondaires couplés à des marqueurs se fixent à l’anticorps primaire, ce qui amplifie le signal et augmente la sensibilité.

Compléments

• Le marquage direct est moins sensible que le marquage indirect, mais reste très sensible pour identifier une protéine et permet les doubles marquages afin de repérer des colocalisations.

• Un exemple de marquage fluorescent associe les marqueurs suivants :

  • Le FITC couplé à un anticorps anti-tubuline marque les microtubules en vert.
  • Le DAPI marque l’ADN nucléaire en bleu.
  • La phalloïdine liée au TRITC marque l’actine des microfilaments en rouge.

• La microscopie visait initialement l’étude de l’organisation cellulaire et permet maintenant d’étudier le fonctionnement cellulaire grâce aux marquages, notamment en fluorescence.

💡 Astuce mémo

Plusieurs secondaires → amplification du signal

📊 Tableaux de synthèse

Marquages cellulaires

Marqueurs de viabilité cellulaire